苏丹红I在辣椒活性成分辣椒红和辣椒油树脂提取过程中的迁移规律研究

武耐英，高 伟 ，杨清山，连运河，张红蕾

（1.河北工程大学材料科学与工程学院, 河北邯郸 056038；2.晨光生物科技集团股份有限公司, 河北邯郸 057250）

辣椒除大量用作食用蔬菜外，由于其中活性化合物辣椒红和辣椒油树脂的存在，使得辣椒在食品、化学和制药工业中应用广泛[1−5]。一般来说，辣椒制品的品质与颜色密切相关，因此有些不法商家应用大量的合成染料来提高产品的审美吸引力。其中，苏丹红染料由于其优良的感官特征和价格低廉的特点，经常非法用作食品染料[6−7]。据欧盟快速警报系统（RASFF）的报告显示，许多辣椒制品中均检出苏丹红染料[8]，这样势必会影响消费者的健康。并且国际癌症研究机构将苏丹红染料列为三类致癌物，包括欧洲共同体在内的大多数国家都不允许将其应用于食品中[9]，并逐步确立了苏丹红的最大残留限量和检测限量[10−12]。为了有效控制各产品中的苏丹红，越来越多学者着手于苏丹红的检测方法及溯源研究[13−15]。

到目前为止，苏丹红的污染来源可归结为三类：非法添加、交叉污染[16]或天然污染[17−18]。其中，苏丹红的天然污染应引起人们广泛关注。前期研究发现，辣椒种植过程中农资材料污染不可避免会引起辣椒苏丹红污染，且只有苏丹红I污染被检出[18]，因此在辣椒红和辣椒油树脂制备过程中，苏丹红I污染会随着提取过程发生迁移，最终进入提取物中。此外，提取、精制过程要经过干燥和浓缩步骤，污染物可能在这些步骤得以富集，使得提取物中污染物含量水平较高[19−20]。因此，必须了解苏丹红I在辣椒活性成分提取过程中的迁移和分配机制，以确保辣椒提取行业的食品安全。有报道指出，大多数苏丹红在辣椒红和辣椒油树脂提取过程中会迁移至辣椒红中[21]，但未对实验中用到的提取检测方法、全过程苏丹红迁移情况进行全面研究，迁移机理也未有涉及。

因此，本研究旨在研究辣椒活性成分提取全过程中各产品苏丹红I含量、苏丹红I总量、色价、总辣椒碱以及迁移率，分析苏丹红I迁移规律及迁移机理。这些结果可为去除或降低辣椒活性成分中的苏丹红I污染提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苏丹红I标准品 德国Dr. Ehrenstorfer公司；辣椒碱（97%）、二氢辣椒碱 （90%） 标准品，美国Sigma公司；乙腈、甲酸、乙酸 色谱纯，美国Fisher公司；正己烷、氯化钠、95%乙醇 分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；1000 kg辣椒 5354号甜椒 采自新疆库尔勒。

超高效液相色谱-串联质谱仪（UPLC-MS/MS），配以BEH C18柱（50 mm×2.1 mm×5 μm） 美国Waters公司；Agilent 1260 高效液相色谱 美国Agilent科技公司；UV-1900 紫外-可见分光光度计日本岛津仪器公司；TH-300B超声波清洗机 济宁天华超声仪器有限公司；XW-80A漩涡混合器 上海精科实业有限公司；FW135研磨机 天津泰斯特仪器有限公司；H-2050R冷冻离心机 长沙湘仪离心机设备有限公司；ZH-001制粒机 河北石家庄新乐市正宏辣椒机械有限公司；Milli-Q 超纯水器 美国Millipore公司；0.22 μm针头过滤器和0.45 μm针头过滤器 上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 辣椒红和辣椒油树脂的提取 提取辣椒红和辣椒油树脂的工艺流程如图1所示，此工艺为优化后的工业生产工艺[22]。实验时弃去辣椒籽，保留辣椒皮与胎座，45 ℃烘干，粉碎、过60目筛。得到的辣椒粉与0.2 MPa的水蒸汽接触30～40 s的同时造粒成圆筒状的辣椒粒。用正己烷（m:v=1:2.5）在55 ℃萃取辣椒粒150 min后，蒸发正己烷，获得红辣素（由辣椒红和辣椒油树脂构成）。随后，在45 ℃加入5%的氯化钠溶液进行沉淀（m:v=2:1）。待固液分离完全后，弃去沉淀，上清液红辣素层用95%乙醇提纯两次。最后，上层液在真空度0.09 MPa、90 ℃下精制1～2 h，得到辣椒油树脂。下层液在真空度0.09 MPa、50 ℃下精制5～6 h，得到辣椒红。

图1 活性成分辣椒红和辣椒油树脂提取工艺流程Fig.1 Scheme for active ingredients paprika red and capsicum oleoresin extraction process

1.2.2 苏丹红I的提取和测定 采集三批辣椒原料，每批样品从不同包装中随机抽取三份样本。按照欧盟修订方法提取苏丹红I[23]。准确称取干燥后的辣椒原料，及提取过程中获得的辣椒粉、辣椒粒、红辣素、辣椒红、辣椒油树脂（固体样品需粉碎混匀，液体样品需混合均匀），按m:v=1:10加入乙腈，用漩涡混合器充分混合，超声500 W提取10 min，10000 r/min，5 ℃下离心5 min，取上清液，用0.22 μm有机滤膜过滤后进行检测。

苏丹红I测定：采用UPLC-MS/MS检测，色谱柱为反相C18Waters ACQUITY BEH 柱（50 mm×2.1 mm，5 μm）；柱温为35 ℃；进样体积为10 μL；流动相由乙腈（溶剂A）和0.1%甲酸水溶液（溶剂B）组成，流速为0.35 mL/min，流动相梯度洗脱条件为：0～0.5 min为70% A，0.5～3 min线性增至95% A，保持1 min，1 min内降至70% A。

质谱条件：电喷雾正离子检测（ESI+），多反应监测模式（MRM）对定性和定量离子进行MS测定。毛细管电压，1.0 kV； 萃取锥孔电压，3.0 V；RF透镜电压，0.0 V；锥孔反吹气流量，50 L/h； 脱溶剂气流量，700 L/h。采用249.3/93.1和249.0/156.1离子对定性，249.3/156.1离子对定量。离子源温度和脱溶温度分别为120 ℃和420 ℃。

用空白样品处理液配成系列苏丹红I标准工作溶液，以峰面积对被测组分的浓度绘制标准曲线。以3倍和10倍信噪比（S/N）确定方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。空白样品中添加三个不同水平的苏丹红I标准溶液（0.4、 4.0、 10.0 μg/kg），测定回收率，考察方法的准确度和精密度。辣椒的不同部分，胎座、果皮、籽中苏丹红I的提取和测定。

1.2.3 色价和总辣椒碱含量的测定 辣椒红中的色素含量可用色价值衡量。辣椒油树脂中的辛辣成分含量可用总辣椒碱衡量，主要包含辣椒碱、二氢辣椒碱和降二氢辣椒碱。为明确活性物质提取方法的可靠性、苏丹红I在提取过程中的迁移规律以及与色价及总辣椒碱迁移规律，对各产品的色价和总辣椒碱均进行测定。

采用GB 1886.34-2015 的方法测定辣椒、辣椒粉、辣椒粒、红辣素、辣椒油树脂、辣椒红色素的色价[24]。根据不同样品色价值调整稀释倍数，确保吸光度值在0.3～0.7之间。色价的计算公式如下：

辣椒、辣椒粉、辣椒粒、红辣素、辣椒油树脂、辣椒红色素中的总辣椒碱含量的提取和测定方法可概括如下[25]： 将25 g辣椒、辣椒粉、辣椒粒分别用95%乙醇回流，2 g红辣素、200 g辣椒红、0.1 g辣椒油树脂分别在80 ℃下用95%乙醇超声辅助提取2 h。用0.45 μm滤膜过滤提取液，反相高效液相色谱-紫外检测器测定。流动相由0.6%乙酸（溶剂A），59.4%水（溶剂B）和40%乙腈（溶剂C）组成，等度洗脱。流动相流速为1.5 mL/min，波长设置为280 nm。

以辣椒碱和二氢辣椒碱作为标准物质建立测定总辣椒碱的标准曲线。以色谱峰面积Y为纵坐标，进样浓度X（mg/L）为横坐标，进行回归，得到辣椒碱和二氢辣椒碱的回归方程分别为：Y=5.84×103−1.62×103X，r2=0.9993；Y=6.13×103−5.07×103X，r2=0.9996。线性范围均为20～100 mg/L。以三倍信噪比计算辣椒碱和二氢辣椒碱检出限分别为0.5 mg/L和0.1 mg/L。因二氢辣椒碱和降二氢辣椒碱结构非常相似（图2），降二氢辣椒碱定量时采用二氢辣椒碱的标准曲线，考虑到两者分子量的不同，将降二氢辣椒碱出峰处峰面积对应的浓度换算为降二氢辣椒碱浓度。以辣椒碱、二氢辣椒碱和降二氢辣椒碱之和计算总辣椒碱含量。

图2 辣椒碱、二氢辣椒碱和降二氢辣椒碱的分子结构Fig.2 Molecular structure of capsanthin, dihydrocapsaicin and nordihydrocapsaicin

1.2.4 迁移率计算 假设提取了1000 kg的辣椒原料，基于每个样本的质量和苏丹红I的含量计算得到苏丹红I总量（μg）。

辣椒、辣椒粉、辣椒粒、红辣素、辣椒油树脂、辣椒红色素的色价、总辣椒碱和苏丹红I的迁移率使用公式（2）计算：

其中，X提取物表示萃取后样品的色价、总辣椒碱和苏丹红总量。X原料分别表示原料辣椒的色价、总辣椒碱和苏丹红I总量。

1.3 数据处理

工艺流程图采用Microsoft Visio 2007绘制。采集三批辣椒样品，每批从不同包装中随机抽取三份辣椒样本。每份辣椒样本及提取得到的辣椒粉、辣椒粒、红辣素、辣椒红和辣椒油树脂的色价、总辣椒碱、苏丹红I含量均平行测定三次，用平均值±标准差表示。苏丹红I迁移率用九个样本的平均值±标准差表示。数据采用SPSS version 21软件处理，应用Duncan’s法进行显著性分析，以P＜0.05为显著性差异，同一列不同字母表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 提取方法的验证

从辣椒中提取的色素和辛辣物质分别是辣椒红和辣椒油树脂。提取过程中每个产品的色价和总辣椒碱迁移率结果见表1。由结果可见，辣椒红的总辣椒碱迁移率和辣椒油树脂的色价迁移率与其它物质存在显著性差异（P＜0.05）。辣椒红含有较多的色素类物质，色价迁移率为96.32%，而辣椒油树脂含有较多的辣味类物质，它的总辣椒碱迁移率为97.43%。辣椒红和辣椒油树脂的总色价迁移率为97.01%，总辣椒碱迁移率为97.57%，表明辣椒红和辣椒油树脂提取过程能较大程度保留辣椒原料中的色价和总辣椒碱，该提取方法是可行的。

表1 辣椒红和辣椒油树脂提取过程中色价和总辣椒碱的迁移率(%)Table 1 Transfer rate of color value and total capsaicinoids during the extraction process of paprika red and capsicum oleoresin(%)

2.2 提取过程各产品中苏丹红I的含量

本研究的辣椒原料中仅检测出苏丹红I，未检到苏丹红II、III和IV存在，该结果与前期研究结果吻合[17−18]。对辣椒、辣椒粉、辣椒粒、红辣素、辣椒红和辣椒油树脂中苏丹红I的检测方法性能进行了研究，结果如表2。线性范围为0.1～20 μg/kg，检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.04～0.09 μg/kg和0.09～0.25 μg/kg，回收率在84.13%～90.25%之间。同时，对6个相同加标样品分别进行分析，评价方法的精密度，相对标准偏差为7.25%～8.76%。结果表明，该方法可以满足苏丹红I检测。

表2 苏丹红I检测方法性能研究Table 2 Major analytical performance for the determination of Sudan I

辣椒中苏丹红I的含量为0.08～0.22 μg/kg（表3），远低于欧洲委员会设定的13 mg/kg[10]。辣椒粉中苏丹红I质量浓度比辣椒中增加了4.5%～12.5%。随后采用造粒的方式来提高过滤和提取效率，由于造粒过程只有形状发生了改变，因此辣椒粒中苏丹红I含量与辣椒粉中持平。正己烷萃取后红辣素的质量约为辣椒粒的1/10，相应地红辣素中的苏丹红I含量约为辣椒粒的9.4～10.7倍，表明辣椒粒中的苏丹红I几乎全部得以萃取至红辣素中。最终，辣椒红中含有0.98～2.94 μg/kg苏丹红I，而辣椒油树脂中未检测到苏丹红I。从结果可以看出，经过工业提取，苏丹红I几乎全部留在辣椒红中。

表3 不同批次提取中各产品质量迁移率及苏丹红I的含量Table 3 Mass transfer rate and concentration of Sudan I in different products of different batches

同时，对辣椒各部分，即辣椒胎座、辣椒皮和籽的干重及其中的苏丹红I分布进行分析，结果见表4。由结果可见，辣椒中的苏丹红I主要存在于辣椒皮中，其残留量占全辣椒的86%，辣椒籽中苏丹红I残留量最少。研究中只选取了辣椒皮和胎座用于粉碎，且辣椒籽中苏丹红I含量较低，所以弃去辣椒籽后，辣椒粉中苏丹红I质量浓度比辣椒中有所增加。

2.3 苏丹红I迁移规律

依据提取时每批样品不同样本的质量和检出的苏丹红I水平，计算出各个产品中苏丹红I的总量（μg），用以计算苏丹红I在每个过程中的迁移率（表5）。

表5 不同产品苏丹红I总含量（μg）和苏丹红I迁移率（%）Table 5 Total Sudan I amount (μg) and transfer rate of Sudan I (%) at different products

在目前的研究中，辣椒籽质量占全辣椒质量的12.10%，籽中苏丹红I总量占全辣椒的4.75%（表4）。工业生产中粉碎过程采用投包割料方式，该过程质量会损失35.20%（表4），这样就意味着辣椒皮和胎座存在23.30%的质量损失，因此辣椒粉中保留了辣椒中苏丹红I总量的70.0%。造粒和随后的提取过程对苏丹红I迁移的影响可以忽略不计（P＞0.05）。几乎所有存在于红辣素中的苏丹红I都转移到辣椒红中，约为辣椒中的67.56%，而辣椒油树脂中未检测到苏丹红I。

表4 辣椒胎座、辣椒皮及籽的干重、苏丹红I含量及苏丹红I总量Table 4 Dry weight, concentration of Sudan I and the total Sudan I amount of paprika pericarp, placenta and seeds

从整个提取过程来看，苏丹红I仅在95%乙醇加入后的分离过程进行了重新分配，在整个提取过程中均未有减少。用95%乙醇分离红辣素后，溶液进入两相体系，由上层醇溶相和下层油溶相组成，苏丹红I将在两相之间分配。包含辣椒碱，二氢辣椒碱和降二氢辣椒碱的辣椒碱类化合物由于极性与乙醇相似而易于转移至上层醇溶相中[26]。相反，辣椒红中的色素主要包括辣椒玉红素和辣椒红素[27]。辣椒中70%～80%的辣椒红色素是以脂肪酸酯形式存在，酯化过程使得辣椒红色素的脂溶性更强[28−29]，因此辣椒红倾向于转移至下层油溶相。文献表明，化合物的亲和力取决于其物理化学性质，如分子量、亲脂性（log P）。苏丹红I的log P为5.86，高于3，所以为高度亲脂性化合物[30]，因此高亲脂性的苏丹红I倾向于进入下层油溶层的辣椒红中。

3 结论

在辣椒油树脂和辣椒红的提取过程中，苏丹红I只在辣椒去籽操作环节去除一部分，其余苏丹红I全部迁移至辣椒红中。辣椒红中苏丹红I约占全辣椒苏丹红I总量的67.56%。苏丹红I迁移性主要是由于与辣椒红相似的脂溶性决定的。本研究中辣椒加工过程中苏丹红I的污染情况、迁移、分配机理的系统性研究，可以为适时调整提取工艺提供可行的建议。