非林地长白山乌杆天麻萌发菌分离鉴定、遗传分析与评价

李雅琪，郜玉钢，臧 埔, ，李兆春

（1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；2.白山靖珍天麻开发有限公司，吉林靖宇 135200）

天麻（Gastrodia elataBl.），具有息风止痉，平抑肝阳，祛风通络之功效[1]。现代药理表明，天麻具有降血压[2]，增加心脑血流量[3]，调节神经系统[4]，抗炎与提高机体免疫[5]、治疗抑郁症[6]、阿尔茨海默症[7]等作用。

国家卫健委发布“关于对党参等9种物质开展按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作的通知国卫食品函〔2019〕311号”后，国内外需求量急剧增加，长白山乌杆天麻（Gastrodia elataBl.f.glauca）是天麻中的“极品”更受到人们的青睐[8]。野生天麻资源匮乏，需人工种植供应。但天麻多代无性种植，因病害重失去栽培价值[9]。有性繁殖天麻种子无胚乳，必须依靠小菇属（Mycena）真菌侵染种胚细胞提供营养物质，才能完成种子萌发[10]。因此萌发菌菌种质量的好坏直接影响着天麻的产量和质量。自1980年，徐锦堂等[11]从天麻种子萌发形成的原球茎中分离出对天麻种子萌发具有促进作用的12种真菌以来，有性繁殖成为天麻栽培的主要方式。秦丽媛等[12−13]对天麻萌发菌小菇生长条件及其多样性进行研究，发现萌发菌小菇属真菌为弱腐生菌，培养条件苛刻，培养过程中存在着生长时间过长，生物量偏低的问题，且多代繁殖过程中易发生种性退化，从而导致天麻萌发率下降。罗阳兰等[14]通过研究不同胁迫条件对天麻种子共生萌发的影响，发现天麻种子共生萌发受多种因素的影响，其中受环境胁迫影响较大。如外来萌发菌与长白山乌杆天麻种子的亲和性不稳定，严重影响了天麻有性繁殖[15]。又由于长白山区已禁止伐林栽培天麻，只能非林地种植，而非林地与林地环境不同。因此筛选适宜长白山乌杆天麻非林地栽培的本地优良萌发菌菌株已势在必行。本研究分离鉴定筛选出与长白山乌杆天麻种子亲和性稳定并适合非林地栽培的优良萌发菌菌株，对提高天麻种子萌发率和天麻产量具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

分离用样品 采集于长白山区吉林省靖宇、辉南等地野生天麻生长地的叶片、野生天麻原球茎，非林地栽培萌发用天麻种子采集于白山靖珍天麻开发有限公司；PDA培养基 本实验室配制；葡萄糖 北京化工厂；琼脂 上海沪试；无水乙醇 北京化工厂；EB（溴化乙锭）Tiangen公司；琼脂糖 西班牙Biowest agarose；真 菌 通 用 引 物ITS4、ITS5 TAKARA公司；1%刚果红染液、真菌基因组DNA提取试剂盒、50×TAE 缓冲液、2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、D2000 DNA Ladder 北京索莱宝科技有限公司。

AUY220电子分析天平 精度为0.0001 g，日本岛津公司；YXQ-LS-100G立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司医疗设备厂；4270电热恒温培养箱 上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司；SW-CJ-2D光学显微镜 南京凯旋电子光学仪器有限公司；SW-CJ-2D超净工作台 江苏通净净化设备有限公司；XW-80A漩涡混合器 江苏海门市麒麟医用仪器厂；Sure Cycler 8800梯度PCR仪 安捷伦科技有限公司；DYY-6B电泳仪 北京六一仪器厂；GGM/D2凝胶成像系统 英国SYNGENE。

1.2 实验方法

1.2.1 萌发菌叶片分离法 将野生天麻生长地采集的树叶在70%酒精中浸泡3 min后，用无菌水冲洗2～3次，接入PDA培养基中，移至恒温培养箱中24 ℃条件下培养，待有菌落出现时，将白色菌落转入新的PDA培养基上，淘汰杂色菌落，该过程重复数次，直至菌株纯化为止[15]。

1.2.2 萌发菌原球茎分离法 将采集的叶片与天麻种子拌匀后播入花盆中，用锯末加砂配土覆盖，每隔15 d喷施适量水分，保持种子在温度为24 ℃湿度为50%的环境中萌发[16]，待种子萌发后采集原球茎。将原球茎用清水洗净，酒精棉轻轻擦拭表面后，在超净工作台中用无菌水冲洗数次，用无菌滤纸擦拭表面除去水分，切成均匀小块接种在无菌PDA培养基上，在恒温培养箱中24 ℃条件下培养，待有菌落出现时，将白色菌落转入新的PDA培养基上，淘汰杂色菌落，该过程重复数次，直至菌株纯化为止[17]。

1.2.3 萌发菌形态学鉴定 将纯化的菌株接种在PDA培养基上，每天在同一时间对各菌落的形态特征（颜色、表面特征、萌发时间、生长速度）进行观察。另接种纯化的菌株，采用周永强等[18]的方法，待菌落生长范围适中，将灭菌后的盖玻片呈45°倾斜插入培养基内，待菌丝爬片之后取出盖玻片，采用1%刚果红染液染色制片，通过光学显微镜观察菌丝形态结构并拍照。参照《真菌鉴定手册》[19]，进行初步的鉴定。

1.2.4 萌发菌分子生物学鉴定 纯化后培养的萌发菌DNA通过真菌DNA提取试剂盒提取，将提取后的DNA纯化并于−20 ℃下储存备用。然后采用大连宝生物公司合成的真菌通用引物ITS4和ITS5对提取的真菌DNA的ITS区进行PCR扩增，PCR反应条件：ITS引物（ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）[20]；PCR反应体系（12.5 μL 2×Taq MasterMix for PAGE，上下游引物10 μmol/L各1.0 μL，DNA模板3.0 μL，去离子水7.5 μL，共25 μL）；PCR变温程序（95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30次循环，最后72 ℃延伸10 min）[21]。扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，利用凝胶成像系统观察是否有特异性条带出现。将PCR产物4 ℃保存送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序得到的碱基序列提交到NCBI数据库中，进行BLAST同源性比对，找出与各菌相似性最高的菌株以确定其生物学分类地位[22]。

1.2.5 萌发菌遗传多样性分析 结合步骤1.2.4的BLAST同源性比对，利用Clustal–W软件对所有序列进行人工校正，使用Mega7.0生物软件计算序列的K-2-P距离，使用邻接法（NJ）构建系统发育树分析比较萌发菌序列的种间和种内遗传距离（自举检验1000次），构建系统发育树[23]。

1.2.6 天麻种子萌发试验 萌发实验参照徐锦堂等[24]的方法，将分离鉴定的各萌发菌接于灭菌的培养基菌袋中，待菌丝长满袋后备用。于5月中旬进行非林地田间栽培试验，称取质量相同的天麻种子以及相同质量的不同萌发菌菌块，搅拌均匀后分别播种于吉林农业大学药植园和白山靖珍天麻有限公司基地的非林地农田。每种萌发菌分别设计10个重复，3个平行组别，4个月后按单位面积（10 cm×10 cm）收获圆球茎，测定其数量、重量和长度，进行评价。

1.2.7 菌种种性退化检验 为了探究分离得萌发菌是否存在多次继代种性退化的问题，对筛选所得优良菌株进行了种性退化检验。在无菌条件下，从分离纯化的母种挑取单菌落接种在无菌PDA培养基上，在恒温培养箱中24 ℃条件下培养，并反复传代6次，每代三次重复，观察继代菌种的萌发时间、生长速度及菌落形态是否有衰退趋势[25]。

1.3 数据处理

数据整理采用Excel 2010软件，显著性分析采用SPSS 19.0软件[26]。

2 结果与分析

2.1 菌落形态学特征

共分离、纯化出15个菌株，其中由叶片分离得6株、原球茎分离得9株萌发菌。因菌丝弱、生长不旺盛等原因，在传代过程中部分菌株遭到淘汰，最后获得6个菌株，JFGL-01、JFGL-02、JFGL-03分离自叶片，JFGL-04、JFGL-05、JFGL-06分离自原球茎。从表1可以看出6个萌发菌菌株的生物学特征各异，菌株菌丝萌发时间在2～3 d，其中JFGL-06菌丝萌发需要的时间最长，其他菌株间菌丝萌发时间差异不明显；比较不同菌株菌丝生长速度可得出：生长速度最快的是JFGL-01菌株，最慢的菌株是JFGL-06，其他菌株菌丝生长速度在0.241～0.269 cm/d范围内，差异不显著（P＞0.05）；从菌丝形态方面进行比较可以发现：6株萌发菌均洁白、绒毛状、气生根发达，JFGL-06呈逆时针方向生长，JFGL-02、JFGL-03、JFGL-04、JFGL-01呈顺时针方向生长，JFGL-05呈辐射状生长。菌落具体形态特征详情见表1和图1。

图1 6株萌发菌的菌落形态及显微观察特征（400×）Fig.1 Colony morphology and microscopic observation characteristics of 6 germinating fungi（400×）

表1 6株萌发菌在相同培养条件下的生长特性Table 1 Growth characteristics of 6 germinating fungi under the same culture conditions

2.2 分子生物学鉴定

各菌株DNA扩增产物电泳结果如图2所示，电泳均只出现一条清晰、明亮条带，在750 bp有条带出现，符合真菌ITS序列长度范围，表明两种通用引物成功地扩增了萌发菌的ITS区基因序列。在BLAST同源性比对中发现，6株萌发菌的碱基序列与NCBI数据库中的注册基因同源性均超过98%，相同碱基覆盖率均超过90%，在GenBank中的对比结果如表2所示。

表2 6株萌发菌在GenBank中同源性比对Table 2 Homology alignment of 6 germinating fungi in GenBank

图2 6株萌发菌PCR产物凝胶电泳图Fig.2 The electrophoresis of PCR products of 6 strains germinating fungi

2.3 遗传多样性分析及系统发育树构建

由BLAST同源性比对发现（图3），6个菌株与Mycena purpureofusca（紫 褐 小 菇）和Mycena citrinomarginata（黄缘小菇）的同源性均为95%以上，通过构建系统发育树进一步分析发现，6个萌发菌株均与Mycena purpureofusca（紫褐小菇）菌株聚类在同一个分支上，自展支持率为99%，亲缘关系密切，说明6个菌株均为Mycena purpureofusca（紫褐小菇）。使用Mega 7.0软件计算序列的K-2-P距离，菌株JFGL-05与菌株JFGL-01、JFGL-02、JFGL-03、JFGL-04、JFGL-06种间遗传距离为0.0016最大；菌 株JFGL-06与 菌 株JFGL-01、JFGL-02、JFGL-03、JFGL-04种间遗传距离为0最小。

图3 基于6株萌发菌ITS序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of 6 germinating fungi

2.4 不同菌株对非林地种植天麻种子萌发的影响

由表3可知，非林地条件下，不同萌发菌萌发长白山乌杆天麻种子原球茎数显著不同（P＜0.05），其中，JFGL-06平均萌发原球茎数最多，JFGL-01次之，而JFGL-02不具备萌发能力。不同萌发菌株萌发所得原球茎长度不同（P＜0.05），由长到短依次为JFGL-06＞JFGL-01＞JFGL-04＞JFGL-03＞JFGL-05＞JFGL-02；不同菌株萌发种子所得原球茎重量不同（P＜0.05），原球茎重量由大到小依次为JFGL-06＞JFGL-05＞JFGL-01＞JFGL-03＞JFGL-04＞JFGL-02。说 明JFGL-06菌株对非林地条件下天麻种子萌发作用和促进生长作用最好。

表3 不同萌发菌菌株对非林地种植天麻种子萌发力影响Table 3 Comparison of germinating power of different germinating fungi

2.5 菌种种性退化检验

如表4、图4所示，在菌种继代过程中，菌株JFGL-06的萌发时间、生长速度及菌落形态与原代相比均无明显退化趋势。

图4 菌株JFGL-06不同继代次数菌落形态图Fig.4 Colony morphology of strain JFGL-06 with different subculture times

表4 菌株JFGL-06不同继代次数生长趋势Table 4 Growth trend of strain JFGL-06 with different subculture times

3 结论与讨论

萌发菌隶属于担子菌纲、伞菌目、口蘑科、小菇属，主要包括紫萁小菇（Mycena osmundieola）、石斛小菇（Mycena dendrobii）、开唇小菇（Mycena asmundicola）三类[27]。萌发菌通过侵染天麻种子为其萌发提供营养基础，是天麻生产中必不可少的共生菌[28]。紫萁小菇和石斛小菇在天麻有性繁殖时被广泛应用，另外汪鋆植[29]等报道兰小菇（Mycena orchidicola）、大白栓菌（Trametes laclinea）的真菌等也可以促进天麻萌发。小菇属真菌虽然种类多，但具有萌发作用的种类所占比例较少，本实验证明Mycena purpureofusca（紫褐小菇）可促进天麻种子萌发，并筛选出适宜非林地栽培的长白山乌杆天麻的本地优良萌发菌JFGL-06，不仅丰富了天麻萌发菌种质资源，还对长白山乌杆天麻有性繁殖具有重要意义。

天麻产区均有天麻种子萌发菌分布，但自然条件下，树叶不易感染土壤中的萌发菌，常造成树叶菌床播种法产量不稳定，空穴率高，人工感染萌发菌是天麻种子萌发更有效的途径，可见分离萌发菌十分必要[30]。但不同地区分离得到的萌发菌，对促进天麻种子萌发的效果是不同的，优良菌株的筛选十分必要。目前关于长白山乌杆天麻萌发菌菌种的亲缘关系无研究报道，本研究分离得6个菌株经鉴定为Mycena purpureofusca（紫褐小菇）的不同亚种,虽然与虞小燕等[31]检验分析的秦巴山区12个天麻萌发菌菌株在遗传上存在一定差异，但同样具有不同程度的萌发效果，并且证明分离自本地的萌发菌JFGL-06促进长白山乌杆天麻种子萌发效果更好。本研究证实不同菌株对天麻种子发芽效果及原球茎生长速度有很大差异，菌株JFGL-06为适宜非林地长白山乌杆天麻种子萌发的最优菌株。但菌株JFGL-06与市场流通商品菌株对非林地长白山乌杆天麻种子萌发力作用的异同有待进一步研究，从根本上解决萌发菌对环境适宜性和与天麻亲和性问题，对提高长白山乌杆天麻产业的发展起到积极的促进作用。