兰州肉苁蓉多糖的组成分析及抗氧化活性

郭俏俪，武志博，周玉碧，甘 霖，王雪芹，郝佳辰，左合君,

（1.内蒙古农业大学沙漠治理学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.阿拉善盟林业治沙研究所，内蒙古阿拉善左旗 750306；3.中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁 810008；4.阿拉善盟科技信息研究所，内蒙古阿拉善左旗 750306；5.阿拉善盟林业和草原局种苗工作站，内蒙古阿拉善左旗 750306；6.阿拉善盟航空护林站，内蒙古阿拉善左旗 750306；7.内蒙古自治区风沙物理与防沙治沙工程重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018）

兰州肉苁蓉（Cistanche lanzhouensis）是列当科肉苁蓉属的一种草本寄生植物，生于荒漠草原、半荒漠的山前平原及沙质梁地和黄土丘陵、河谷沟等地，分布地仅为甘肃兰州[1]。兰州肉苁蓉寄主单一，目前仅发现其寄生于植物红砂（Reaumuria soongorica）的根上[2]。肉苁蓉入药始载于《神农本草经》，为名贵的滋补中药材[3]，目前以肉苁蓉作为原料广泛应用于国家食品药品监督管理总局已批准的保健食品，主要的产品型态有酒类、茶类、片剂、颗粒、胶囊、口服液等[4]。近年来，由于肉苁蓉资源被广泛开发利用，大量采挖造成其资源匮乏，研究发现其同属不同种植物同样具有与之相近的有效成分[5−7]，因此我国不少地区也将本属其它植物入药使用[8]，兰州肉苁蓉在兰州地区被作为肉苁蓉替代品入药[9]。

多糖是由多个单糖通过糖苷键连接而成的一种高分子化合物，多糖结构复杂，化学成分多样。肉苁蓉药材主要含苯乙醇苷类、环烯醚萜、木脂素及其苷类、酚苷、单萜苷、生物碱、糖类、糖醇、甾醇等成分[10]，研究表明肉苁蓉多糖具有调节免疫活性[11]、保护神经[12]、抗骨质疏松[13]等药理作用，肉苁蓉多糖也对于衰老模型小鼠的学习记忆能力有一定的改善[14]，具有增强记忆力的功能。自由基和天然抗氧化剂的研究是目前抗氧化和抗衰老方面研究的重点内容。自由基是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有高度的氧化活性，极不稳定，若体内自由基积累过多或清除过慢，会造成机体内生物大分子物质和组织器官的损伤，加速机体衰老并引发各种疾病。近年来，随着人们对合成抗氧化剂毒性的认识，研究和开发安全的天然抗氧化剂已成为一个重要的研究方向。目前，肉苁蓉多糖对于自由基的清除能力也有一定的研究[15]，肉苁蓉多糖的研究比较成熟，针对肉苁蓉多糖含量和相对分子质量及分布的测定研究也较广泛[16]，但对兰州肉苁蓉的研究尚浅，仅有药效学实验表明，兰州肉苁蓉具有一定的润肠通便作用[9]。且研究得出兰州肉苁蓉中毛蕊花糖苷的含量高于肉苁蓉[17]，尚未有兰州肉苁蓉多糖测定和组成分析及其抗氧化作用的研究报道。

针对目前所存在的问题，本文拟以兰州肉苁蓉为研究对象，提取其中的多糖类物质，并对其多糖进行分离，采用高效凝胶渗透色谱法（High Performance-Gel Permeation Chromatography，HPGPC）对多糖的分子量进行测定，并利用高效快速、灵敏度较高、稳定性好的高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）法深入研究其多糖的组成[18]，最后采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH）自由基清除能力和总抗氧化能力试验分析其抗氧化活性，旨在研究兰州肉苁蓉的单糖组成和抗氧化作用，为证实兰州肉苁蓉的功效和提高兰州肉苁蓉附加价值提供理论依据，也为其资源的开发利用提供一定的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

兰州肉苁蓉采于兰州九州区，由甘肃农业大学孙学刚教授鉴定为列当科肉苁蓉属植物兰州肉苁蓉；二乙氨乙基纤维素（DEAE纤维素） 上海恒信化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）美国Sigma-Aldrich公司；总抗氧化能力试剂盒（ABTS法） 碧云天生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。

YB-250型高速多功能粉碎机 永康市速锋工贸有限公司；UV-5500PC紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；SJZX多功能酶标仪 珀金埃尔仪器有限公司；LC-10AD液相色谱仪（配有可变波长紫外检测器和CLASS-VP色谱工作站） 岛津日本公司。

1.2 实验方法

1.2.1 兰州肉苁蓉粗多糖的制备 称取兰州肉苁蓉肉质茎鲜样2.5 kg，将其进行切片后按1:5（v/v）料液比加入12.5 L蒸馏水煮沸3 h，进行三次煮沸提取，煮沸后过滤，收集三次过滤液，合并后加75%乙醇静置过夜，醇沉液用离心机4000 r/min进行离心30 min，收集沉淀，将沉淀物挥发乙醇用冷冻干燥机进行干燥[19]，得粗多糖CLP。

1.2.2 兰州肉苁蓉多糖的柱层析 取一定量DEAE-纤维素充分浸泡溶胀后，搅匀并进行脱气处理。采用DEAE-纤维素阴离子交换色谱柱（55 cm×10.5 cm I.D.）装柱后依次用3倍柱体积的蒸馏水和3倍柱体积0.5 mol/L NaCl溶液进行平衡。

准确称取100.00 mg粗多糖溶于10 mL超纯水中，以11.00 mL/min的流速进行上样，后以同样流速进行蒸馏水洗脱，收集3倍柱体积洗脱液，浓缩，冷冻干燥后得中性糖CLP-1；以19.63 mL/min流速进行0.5 mol/L NaCl溶液洗脱，收集3倍柱体积洗脱液，经MD 34透析袋（透析分子量：3500 D）透析后浓缩，冷冻干燥得酸性糖CLP-2。

1.2.3 兰州肉苁蓉多糖的紫外光谱检测 将CLP-1、CLP-2样品配制为1.0 mg/mL浓度多糖，在紫外可见分光光度计的210～600 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，根据在260 nm和280 nm处是否出峰来检测多糖样品中是否含有蛋白质及核酸。

1.2.4 兰州肉苁蓉多糖的基本成分测定

1.2.4.1 总糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法测定样品中的总糖含量[20]。用移液管分别量取0.1 mg/mL的标准葡萄糖溶液0、0.2 、0.4、0.6、0.8、1.0 mL转于玻璃试管（1.8×18 cm）中，向试管中加蒸馏水补至1.0 mL，每组进行三个重复，分别于每支试管中加入6%苯酚试剂0.5 mL，浓硫酸2.5 mL，迅速振荡摇匀，然后冷却至室温。在分光光度计λ490nm处测定吸光度。以吸收度为纵坐标，糖含量为横坐标，得标准曲线，计算回归方程。分别取浓度为0.1 mg/mL的样品溶液l mL，每个浓度三个重复，分别于每支试管中加入6%苯酚试剂0.5 mL，浓硫酸2.5 mL，迅速振荡均匀，冷却至室温。在λ490nm处测定吸光度A。根据样品吸光度值和回归方程计算各样品中的糖含量。

1.2.4.2 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝法测定样品的蛋白质含量[21]。取不同浓度的标准品和浓度为0.1 mg/mL的样品溶液l.0 mL，进行三个重复，分别向每支试管中加入考马斯亮蓝溶液4.0 mL，快速振荡摇匀后，静置5 min后在分光光度计λ595 m处测定光吸收值A595nm，根据标准曲线方程计算各样品中的蛋白质含量。

1.2.4.3 糖醛酸含量的测定 采用间羟基联苯法测定样品中糖醛酸含量[22]。取不同浓度的标准品和0.1 mg/mL的样品溶液0.4 mL，向各管溶液中分别对应加入40 μL氨基磺酸（pH2.5），振荡摇匀后，向各管加入2.5 mL浓硫酸溶液，将各管中的溶液混合均匀，沸水浴25 min，在取出后立即用凉水（流动水）冷却到室温，向各管中分别加入40 μL 0.3%间羟基联苯/0.5%氢氧化钠溶液，混匀后，常温放置30 min，测定吸光度A525nm值，测定后再根据回归方程计算各样品中糖醛酸含量。

1.2.5 兰州肉苁蓉多糖的分子量测定 采用高效凝胶色谱仪HPGPC[23]法测定兰州肉苁蓉多糖相对分子量。

1.2.5.1 样品的前处理 将CLP、CLP-1、CLP-2样品各称取10.00 mg溶于1.00 mL 0.15 mol/L NaCl溶液中，并经过0.22 μm微滤膜过滤处理，取多糖混合标准品进行相同处理。

1.2.5.2 色谱条件 TSK-Gel G3000 PWXL（7.8 mm I.D.×30 cm）色谱柱，柱温设定为40 ℃，流动相采用0.15 mol/LNaCl溶液，流速设定为0.6 mL/min，进样量设定为20 μL，使用示差检测器进行检测，记录各样品的洗脱体积。

1.2.6 兰州肉苁蓉多糖的单糖组成测定 采用高效液相色谱仪HPLC进行单糖组成测定。

1.2.6.1 样品的前处理 a. 酸水解 称取10.00 mg兰州肉苁蓉多糖样品溶于1 mL 2 mol/L TFA（三氟乙酸）溶液中，于120 ℃烘箱加热2 h后将液体转移至蒸发皿中，于45 ℃水浴锅中蒸发至无酸味[24]。

b. 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化向蒸发皿中加入1 mL NaOH/PMP（1，3，5-吡唑酮）溶液（0.5 mL 0.5 mol/L PMP和0.5 mL 0.3 mol/L NaOH等量均匀混合），充分溶解样品后，每个样品取100 μL溶液分别置于1.5 mL离心管中，于70 ℃水浴锅衍生反应30 min，冷却后向每个管中加入50 μL 0.3 mol/L HCl，涡旋混匀2 s后加入50 μL UP水，涡旋混匀，再加入1 mL CHCl3（氯仿）涡旋混匀后萃取，吸去下层的CHCl3层，保留上层H2O层，按此步骤重复操作3遍[25−26]。

c. 9种单糖混合标准品处理 取9种单糖各50 μL加入1.5 mL离心管中涡旋混匀后加入50 μL 0.5 mol/L PMP和50 μL 0.3 mol/LNaOH（v/v=1:1），置于70 ℃水浴锅中水浴30 min后加入50 μL 0.3 mol/L HCl和50 μL H2O，再加入1 mLCHCl3（氯仿）涡旋混匀后萃取，用注射器吸去下层的氯仿层，保留上层H2O层，按此步骤重复操作3遍。将保留下的水层经0.22 μm水系滤膜过滤加进进样瓶。

1.2.6.2 色谱条件 Bonshell C18plus（7.8 mmI.D.×30 cm）色谱柱，柱温35 ℃，流动相为82% 0.1 mol/L pH=7.0磷酸缓冲液（PBS）和18%乙腈（CH3CN），上样时间为25 min，流速为0.5 mL/min，进样体积2 μL，在波长为245 nm的紫外检测器进行检测。

1.2.7 兰州肉苁蓉多糖的体外抗氧化实验 将兰州肉苁蓉多糖配制成浓度为0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的多糖溶液，测定其DPPH自由基清除率以及总抗氧化能力。多糖清除自由基测定参考Blois[27]和Wang[28]的方法，并作适当修改。不同浓度的2 mL样品溶液，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 95%乙醇溶液，混匀，在避光条件下室温放置15 min，然后在转速4000 r/min条件下离心15 min。用分光光度计测定在517 nm下的吸光值，以Vc作对照组。混合液的吸光值与其清除自由基能力呈负相关。DPPH自由基清除能力的计算公式如下：

式中，A0：2 mL DPPH溶液+2 mL 95%乙醇；Ai：2 mL DPPH溶液+2 mL样品溶液；Aj：2 mL样品溶液+2 mL 95%乙醇。

总抗氧化能力的测定采用总抗氧化能力检测试剂盒ABTS快速法进行检测，按其说明书进行操作和计算。取10 mmol/LTrolox标准液用双蒸馏水稀释成浓度为：0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mmol/L的溶液进行标准曲线的制作，96孔板的每个检测孔里加入20 μL的过氧化物酶工作液，加入10 μL样品或标准液，再加入170 μL的ABTS工作液，混匀后静置6 min，采用酶标仪在405 nm下进行测定。所得总抗氧化能力标准曲线为Y=−1.9001X+2.1039（R2=0.9968），线性良好，其总抗氧化能力的计算公式如下：

式中，测定OD值：酶标仪上测定的吸光度。

1.3 数据处理

每组实验进行三次重复，数据由三组平行实验完成，所得数据由SPSS Statistics 22计算，Excel 2010进行数据表格绘制、OriginPro 8进行绘图处理。

2 结果与分析

2.1 兰州肉苁蓉多糖组成分析

2.1.1 紫外光谱分析 蛋白质中含有的酪氨酸和色氨酸对280 nm的紫外线有最大的吸收值[29]。根据图1可以看出，CLP-1在280 nm处出现明显吸收峰，证明其可能含有糖蛋白；CLP-2在260 nm以及280 nm处均没有明显峰，但其紫外吸收谱线较高，可能是其本身颜色较深的缘故，因此无法准确判断其是否有核酸和蛋白质存在。

图1 紫外可见全波长扫描曲线图Fig.1 UV-visible full spectrum scan

2.1.2 兰州肉苁蓉多糖基本成分分析 DEAE-纤维素阴离子交换色谱柱层析能够分离多糖，主要是其可吸附离子型的物质和杂质于柱上，其中性糖则可顺利流出，从而达到分离的目的[30]，通过改变洗脱液中的盐浓度，可进一步洗脱得到酸性多糖等。将水洗脱液浓缩干燥后得中性糖CLP-1 34.68 mg，经NaCl溶液洗脱浓缩干燥后得酸性糖CLP-2 16.52 mg。

实验所得总糖含量的标准曲线为Y=12.104 X +0.0373，R2= 0.9959；所得蛋白质的标准曲线为Y=0.0079X+0.0134，R2=0.9951；糖醛酸的标准曲线为Y=0.0148X+0.0046，R2=0.9993。对分离前、后兰州肉苁蓉的基本成分进行测定，其总糖、蛋白质、糖醛酸含量所占比例如表1。DEAE-纤维素阴离子交换色谱柱对粗多糖更多的是起到了分离作用，由于总糖的测定以葡萄糖为标准品，因此CLP-1和CLP-2中的总糖含量比多糖中真实值偏小，但能明显看出CLP、CLP-1和CLP-2三者中的化学组成成分有一定的差异，其中，CLP-1中总糖和蛋白质含量最高，CLP-2中糖醛酸含量最高，三者的总糖与糖醛酸含量差异性显著（P＜0.05），CLP与CLP-2中蛋白质含量差别并不大，证明盐洗并未对CLP中的蛋白质含量造成很大的影响。经过DEAE-纤维素阴离子交换色谱柱后的实验结果中蛋白质结果偏大，极大可能是形成了结合蛋白[31]。

表1 兰州肉苁蓉多糖的基本成分Table 1 Basic composition of polysaccharides from Cistanchelanzhouensis

2.1.3 兰州肉苁蓉多糖分子量 根据标准品的分子量（Mw）和出峰体积（Ve），柱子的外水体积Vo=6.049 mL，总体积Vt=13.234 mL，依据公式Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo），得回归方程Kav=−0.1897lgMw+1.039，R2=0.9926。CLP-1、CLP-2的实验结果如图2所示，代入方程可得其Mw的值，进一步计算得出其数均分子量Mn、重均分子量Mw和分散系数D，如表2所示，数均分子量和重均分子量是按不同的统计方法的平均数分子量来表征分子的大小，根据重均分子量和数均分子量可得到其分布宽度D，D值越大证明其分散程度越大。由表2可以看出CLP-1和CLP-2的分子量主要分布在0～10 kDa之间，因此其为不均一的小分子量多糖。采用HPGPC鉴定兰州肉苁蓉粗多糖经DEAE-纤维素柱层析分离后的中性糖CLP-1和酸性糖CLP-2，2种兰州肉苁蓉多糖在洗脱时按分子量大小依次被洗脱，按出峰顺序，其分子量大小如表2所示，且其HPGPC图谱上均呈现5个以上洗脱峰，峰形宽窄不同并且不对称，证明兰州肉苁蓉多糖具有不均一性，从而推断出CLP-1和CLP-2均是由几种多糖组成的混合物[32]。

图2 CLP-1、CLP-2的HPGPC图Fig.2 HPGPC of CLP-1 and CLP-2

表2 保留峰时间与分子量计算Table 2 retention peak time and molecular weight calculation

2.1.4 兰州肉苁蓉多糖中单糖组成成分分析 根据HPLC分析，9种单糖标准品、CLP-1和CLP-2的色谱峰及出峰时间如图3所示，对比9种单糖标准品的保留时间，得出CLP-1中较明显的5种单糖及占比分别为：甘露糖2.78%、半乳糖醛酸4.07%、葡萄糖88.62%、半乳糖1.80%、阿拉伯糖2.39%；CLP-2中较明显的4种单糖及占比分别为：鼠李糖5.79%、半乳糖醛酸7.78%、葡萄糖9.99%、半乳糖13.30%，且在12.58 min处出现的色谱峰介于木糖（12.33 min）和阿拉伯糖（12.65 min）中间，需进一步实验证明其单糖的种类。整体来说，水解后的CLP-1和CLP-2中的单糖含量有很大差别。其中，CLP-1中葡萄糖相对含量高达88.62%，CLP-2中仅为9.99%。且CLP-2中鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖含量均为5%以上，色谱峰较明显，且其半乳糖醛酸含量远远高于CLP-1，进一步证明分离所得CLP-2多糖为酸性多糖。

图3 单糖组成HPLC图Fig.3 HPLC of monosaccharide composition

2.2 兰州肉苁蓉多糖的抗氧化分析

2.2.1 DPPH自由基清除结果 DPPH法是一种灵敏、快速、简便的评价物质抗氧化活性的方法[33]。由图4可明显看出，兰州肉苁蓉多糖清除DPPH自由基的能力整体弱于Vc，Vc对DPPH自由基的清除率为95.45%，CLP和CLP-1对DPPH自由基的清除率明显高于CLP-2，在0.25～4.0 mg/mL的浓度范围内，随着浓度的增加，CLP、CLP-1对DPPH自由基的清除率先上升后平稳，当浓度达到2.0 mg/mL时，CLP-1对DPPH自由基的清除率为91.73%，浓度为1.0 mg/mL时，CLP对DPPH自由基的清除率为80.90%。CLP、CLP-1对DPPH自由基清除能力的IC50分别为0.438、0.383 mg/mL。

图4 DPPH自由基清除率图Fig.4 DPPH radical scavenging capacity

2.2.2 总抗氧化能力（ABTS法）实验结果 ABTS自由基呈通常呈绿色，但与抗氧化剂结合后被还原，颜色消失，在734 nm或405 nm波长处测定其吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力[34]。Trolox是一种VE的类似物，具有和VE相近的抗氧化能力，用作其它抗氧化物总抗氧化能力的参考。根据总抗氧化能力（ABTS法）试剂盒实验方法，Trolox浓度可作为样品抗氧化能力的对比指标。在0～4.0 mg/mL的浓度范围内，随着浓度的增加，CLP、CLP-1和CLP-2的总抗能力均处于上升趋势，其中，CLP-1的总抗氧化能力的增加趋势明显高于CLP和CLP-2。虽然兰州肉苁蓉多糖的总抗氧化能力明显低于Vc，总抗氧化能力较弱，但总体来说随浓度增大，CLP、CLP-1、CLP-2的总抗氧化能力不断增强，浓度越高总抗氧化能力越强（图5）。

图5 ABTS测定总抗氧化能力Fig.5 ABTS measure total antioxidant capacity

由DPPH自由基清除实验和总抗氧化能力实验得出，CLP、CLP-1和CLP-2均具备一定的抗氧化活性，尤其是在DPPH自由基清除方面，浓度为2.0 mg/mL的CLP-1的DPPH自由基清除率高达91.73%，同等浓度下，Vc的清除率为95.55%，其清除能力与Vc相近。

3 讨论与结论

兰州肉苁蓉作为肉苁蓉属同属植物，其形态、生理特征均与肉苁蓉相似，但其有效成分又与其有所差别，能否代替肉苁蓉入药目前尚存在争论。本文通过HPGPC法对兰州肉苁蓉多糖研究初步证明其多糖分子量主要分布在0～10 kDa之间，含多个洗脱峰，为不均一小分子量杂多糖，其实验结果与郭元亨[35]在荒漠肉苁蓉的分子量研究中较为相似。

经HPLC测定后发现，兰州肉苁蓉中性糖CLP-1中含有大量的葡萄糖，而吴向美等[36]对肉苁蓉中性多糖的研究中证明其由葡萄糖组成，CLP-2中有鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等；吴波等[37]采用薄层层析法对野生肉苁蓉分离纯化后的多糖进行研究也得出其含有鼠李糖、葡萄糖和半乳糖。因此证明兰州肉苁蓉分离纯化后与肉苁蓉具有相同的单糖组分。且本文实验得出其多糖中含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖，这与王鑫彤等[38]研究肉苁蓉中单糖组成的结果一致，CLP-2中酸性糖成分半乳糖醛酸含量明显高于CLP-1。杨婷等[39]实验表明管花肉苁蓉药渣中的多糖具有抗氧化活性，且浓度为0.04 mg/mL时其DPPH自由基清除率为59%，同浓度下Vc的清除率为89%，且滕立平等[40]实验得出管花肉苁蓉粗多糖对DPPH自由基清除能力的IC50为0.079 mg/mL，而兰州肉苁蓉粗多糖对DPPH自由基清除能力的IC50为0.438 mg/mL。证明兰州肉苁蓉的抗氧化能力弱于管花肉苁蓉。

本实验采用传统水提醇沉法对兰州肉苁蓉进行提取，通过DEAE-纤维素柱层析将兰州肉苁蓉粗多糖CLP进行分级纯化，得到中性糖CLP-1和酸性糖CLP-2。对3种多糖进行总糖、蛋白质、糖醛酸含量的测定和紫外光谱扫描，并进行分子量、单糖组成的测定和抗氧化活性实验，可得出如下结论：CLP、CLP-1和CLP-2三者组成成分相似，但各自含量差别较大。DEAE-纤维素色谱柱更多地起到了分离作用和初步纯化作用，纯化效果不明显。CLP-1和CLP-2均有多个洗脱峰，且分子量分布都在0～10 kDa之间，证明兰州肉苁蓉多糖为小分子量的杂多糖。对CLP1-1和CLP1-2进行单糖组成测定，得出CLP-1中较明显的单糖及占比为：甘露糖2.78%、半乳糖醛酸4.07%、葡萄糖88.62%、半乳糖1.80%、阿拉伯糖2.39%；CLP-2中为：鼠李糖5.79%、半乳糖醛酸7.78%、葡萄糖9.99%、半乳糖13.30%。根据抗氧化实验结果分析，CLP1-1的抗氧化效果最好，其DPPH自由基清除的IC50为0.383 mg/mL，且同一浓度下总抗氧化能力高于CLP和CLP-2。

综上可知，本文针对兰州肉苁蓉多糖的组成分析及抗氧化活性方面进行了探索性研究，得到了科学的实验结果，并且取得了明显研究进展，在目前文献中尚未见有关兰州肉苁蓉多糖的相同报道，所得结果对于兰州肉苁蓉资源的深入开发利用具有一定参考价值，且兰州肉苁蓉作为重要的沙产业产品，其资源的开发利用能够进一步带动我国荒漠地区经济发展，因此关于兰州肉苁蓉多糖的研究具有重要意义，有待进一步深入研究。