卵丘颗粒细胞质量及IL-6、CRP变化对IVF-ET治疗子宫内膜异位症不孕临床结局的影响

焦 艳 夏红慧

1.湖北省武汉商职医院(430000)；2.湖北省中西医结合医院

子宫内膜异位症(EMS)是导致不孕的主要原因之一[1]。体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗不孕症疗效确切[2]。但研究显示，相对非EMS因素导致不孕症而言，EMS患者IVF-ET结局较差[3]。有研究发现，卵丘颗粒细胞凋亡可导致多囊卵巢综合征患者卵母细胞质量降低影响IVF-ET结局[4]。有文献报道，白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子可增加卵丘颗粒细胞氧化应激水平造成线粒体损失影响IVF-ET结局[5]。EMS患者存在异常炎症反应，可表现为血清C反应蛋白(CRP)水平升高[6]。本研究通过检测EMS患者卵泡液IL-6和CRP水平以及卵丘颗粒细胞凋亡情况，分析对EMS患者IVF-ET结局影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2018年1月—2020年1月在医院生殖中心进行IVF-ET治疗患者临床资料，因EMS行IVF-ET治疗为EMS组，因男性因素行IVF-ET治疗为对照组。纳入标准：①EMS组经腹腔镜证实为卵巢型EMS囊肿合并不孕；②对照组为因男方少弱畸精子症造成不孕；③输卵管造影显示双侧输卵管通畅、无梗阻、粘连等炎症表现；④基础内分泌及月经周期正常；⑤男性可正常进行体外受精无治疗禁忌征。排除标准：①女方年龄≥40岁，周期数≥2个；②子宫明显增大合并腺肌症或子宫肌瘤；③依从性差。入组对象签署知情同意书，研究经医院伦理委员会审核通过。

1.2IVF-ET治疗

EMS组：患者进入IVF-ET治疗周期前B超显示合并囊肿且≥10mm，先行囊肿穿刺术，明确为囊肿后抽吸以生理盐水反复冲洗至冲洗物澄清。两组均采用长方案促进排卵：于月经第5天，炔雌醇环丙孕酮片(德国Bayer Weimar GmbH und Co.KG)口服，1片/d，共21天；服药后第19天，注射用醋酸曲普瑞林(达菲林)(法国Ipsen Pharma Biotech)皮下注射，0.1mg/次，1次/d；达到降调标准后，根据窦卵泡数加用重组人促卵泡激素注射液(果纳芬)(意大利Merck Serono S.p.A)皮下注射，150～300IU/d；卵泡直径≥18mm或卵泡直径超过17mm≥3个，注射用绒促性素(丽珠集团丽珠制药厂)肌内注射，5000～10000U/次；36～38h后经阴道超声引导下取卵，检出卵泡液中卵冠丘复合体，置37℃ 6%CO2培养箱，预培养2～3h后行常规受精；受精后第2～3天选取优质胚胎，经腹部B超引导下行胚胎移植。移植后14天抽取外周血检测血清β绒毛膜促性腺激素(β-hCG)水平确定生化妊娠，移植后28天行阴道超声检查，宫腔内见胚芽和心管搏动确定为临床妊娠。

1.3 检测及观察指标

①基线资料：年龄、不孕年限，体质量指数(BMI)，窦卵泡数；取外周静脉血，酶联免疫吸附法测定血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和雌二醇(E2)水平，试剂盒购置于上海康朗生物科技有限公司。②卵泡液炎症因子水平：穿刺收集卵泡液，分离出不含血液的卵泡液，选取卵泡径线10mm卵泡离心取上清液，酶联免疫吸附法测定卵泡液IL-6和CRP水平，试剂盒购置于上海康朗生物科技有限公司。③卵丘颗粒细胞凋亡：卵泡液收集和处理方法同上，收集由卵母细胞上脱落的新鲜卵丘颗粒细胞，4℃离心，加入甲醛溶液重悬细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，室温孵育10min；加入Buffer溶液500μl悬浮细胞后，依次加入Annexin V-FITC溶液和PI溶液(上海锐赛生物技术有限公司)，室温避光孵育10min；利用流式细胞仪(美国BD公司，型号Accuri C6)检测卵丘颗粒细胞凋亡情况。④IVF-ET结局：受精率(%)=正常受精卵数/获卵数×100%，卵子成熟率(%)=取卵日成熟卵子数/获卵数×100%。⑤妊娠结局：临床妊娠率(%)=临床妊娠例数/移植周期总数×100%，多胎率和流产率。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 两组基线资料比较

EMS组98例，按病变累及部位、数目、大小、粘连程度分期为Ⅰ期28例，Ⅱ期37例，Ⅲ期26例，Ⅳ期7例。对照组87例。两组基线资料比较无差异(P>0.05)。见表1。

表1 两组基线资料比较

2.2 两组卵泡液炎症因子水平比较

EMS组卵泡液IL-6(364.23±48.53 ng/L)和CRP(10.73±0.48 ng/ml)水平高于对照组(43.25±38.42 ng/L、3.12±0.52 ng/ml)(t=31.114、64.521，均P<0.05)。

2.3 两组卵丘颗粒细胞凋亡率比较

EMS组卵丘颗粒细胞凋亡率(25.2±3.4)%高于对照组(19.2±3.5)%(t=7.411，P<0.001)。图1(855页)。

2.4 两组IVF-ET和妊娠结局比较

EMS组受精率(64.2±5.4)%和卵子成熟率(65.8±5.6)%低于对照组(71.3±4.6、84.7±6.3)%(t= 5.974、13.380，均P<0.001)。多胎率和流产率两组比较无差异(P>0.05)，临床妊娠率EMS组低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组妊娠结局比较[例(%)]

2.5EMS患者卵泡液炎症因子水平及卵丘颗粒细胞凋亡率与IVF-ET结局关系

EMS组卵泡液IL-6和CRP水平及卵丘颗粒细胞凋亡率与受精率、卵子成熟率和临床妊娠率均呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 EMS患者各观察指标与IVF-ET结局相关性

3 讨论

EMS是由具有活性的内膜细胞种植于子宫内膜以外位置的妇科疾病。目前EMS致不孕病因尚不明确，多认为由免疫、生殖内分泌、子宫内膜容受性、盆腔解剖结构和内环境等因素共同作用引起[7]。IVF-ET是目前治疗不孕症较成熟技术，但治疗后不孕妇女着床成功率仅有15%，其结局受多种因素影响[8]。赵菲[9]研究发现，不孕症患者HCG日黄体酮水平、优质胚胎数、年龄等可影响IVF-ET结局；刘海霞[10]等研究发现，培养系统、温度、湿度、pH值等环境因素也可影响IVF-ET结局。

李安吉[11]等研究发现，EMS不孕患者促排卵后受精率较低可能与卵泡液中炎症因子介导的卵泡微环境改变导致卵泡发育障碍、卵母细胞质量受损有关。超排过程为炎症反应过程，CRP可通过参加机体非特异性免疫，激活补体系统和中性粒单核吞噬细胞产生细胞因子引发炎症反应。本研究结果显示，与男性因素导致的不孕症患者比较，EMS患者卵泡液IL-6和CRP水平明显升高，提示EMS患者存在炎症反应。排卵是卵细胞及其周围卵丘颗粒细胞被排出的过程，卵丘颗粒细胞主要与卵母细胞相互作用共同调节卵泡成熟、排卵和受精过程，常用于研究细胞增殖、分化和细胞相互作用及其信号转导通路和分子机制，尤其是对研究IVF-ET中卵子发生发育相关机制有着重要意义。曹文丽等[12]研究发现，卵丘颗粒细胞端粒长度与卵母细胞成熟度和IVF-ET结局密切相关；Zhang等[13]研究发现，晚期EMS患者卵丘颗粒细胞凋亡对IVF-ET治疗后妊娠率有一定影响。本研究结果显示，EMS患者卵丘颗粒细胞凋亡率高于对照组患者，可能与炎症因子刺激和卵泡闭锁有关[14-15]。黄柳静等[16]研究发现，合并EMS不孕症患者人工受精成功率和IVF-ET后临床妊娠率较低。本研究结果显示，EMS患者受精率、卵子成熟率和临床妊娠率均低于男性因素导致的不孕症患者。本文经Pearson分析得出，EMS患者卵泡液IL-6和CRP水平及卵丘颗粒细胞凋亡率与受精率、卵子成熟率和临床妊娠率呈负相关，提示卵泡液IL-6和CRP高水平以及高卵丘颗粒细胞凋亡率可降低EMS患者IVF-ET治疗的受精率、卵子成熟率和临床妊娠率。

综上所述，EMS患者IVF-ET结局较差，卵泡液IL-6和CRP水平以及卵丘颗粒细胞凋亡率与IVF-ET结局密切相关，可能成为预测IVF-ET结局的有效指标。