萝卜硫素对大鼠子宫内膜异位组织Nrf2/Keap1/HO-1信号通路影响

陈 帆 高 扬 边文玲 李玉洁

新乡医学院第三附属医院(453003)

近年来，随着分子生物学和病理生理学的不断发展，人们发现子宫内膜异位症(EMs)的发病过程与活性氧(ROS)和抗氧化物质的失衡密切相关[1]。Nrf2/Keap1/HO-1信号通路在维持机体氧化平衡中发挥着至关重要的作用。核因子E2相关因子2(Nrf2)属于亮氨酸(CNC)调节蛋白家族成员之一，是机体调节抗氧化应激反应的重要的转录因子，Kelch样ECH相关蛋白(Keap1)是Nrf2的特异性受体。正常生理状态下，Nrf2与Keap1偶联形成聚合物，Nrf2处于相对失活状态；在氧化应激等状态下时，Keap1的构象发生改变，Nrf2从二聚体上解离并转移至细胞核，启动抗氧化反应元件，调控下游抗氧化基因如血红素氧合酶-1( HO -1)等的表达，清除多余的氧自由基，从而发挥抗应激作用[2-3]。萝卜硫素(SFN)是从十字花科植物中提取得到的一类异硫氰酸盐，具有抗炎、抗氧化等生物学作用[4]。近年研究发现SFN可激活Nrf2信号通路，上调HO-1等抗氧化蛋白的表达[5-6]。基于此，本实验通过运用SFN治疗EMs大鼠，从Nrf2/Keap1/HO-1信号通路蛋白表达的方面探讨其治疗EMs的作用机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雌性健康未孕SD大鼠，鼠龄8～12周，体质量200～250g，购于安徽医科大学实验动物中心。实验开始前适应性饲养1周。光照与黑暗每12 h交替进行，室内温度保持在(24±2)℃，相对湿度65%。

1.2 试剂与仪器

SFN(含量≥99%)购自上海源叶生物有限公司；孕三烯酮胶囊购自华润紫竹药业有限公司；兔抗大鼠Nrf2、Keap1、HO-1及β-actin单克隆抗体、二抗山羊抗兔IgG均购自美国Sigma公司；实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒购自德国Roche公司；大鼠 β-actin内参引物购自上海生物工程公司；Trizol(总RNA抽提试剂)、cDNA合成试剂盒RIPA裂解液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒等购自上海碧云天生物技术有限公司。220型多通道PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)；DYCZ-24DN 型垂直电泳仪(北京六一仪器厂)；Invitrogen E-Gel Imager凝胶成像仪(美国Thermo公司)；7500型Real-time PCR仪(德国Eppenndorf Centrifuge公司)；Milli-Q 超纯水系统(美国 Millipore 公司)。

1.3 方法

1.3.1内异症动物模型的建立造模组术前给予己烯雌酚0.02 mg/kg灌胃5 d，使大鼠处于动情期。参照改良后的EMs造模方法[7-8]，麻醉并固定大鼠后，对腹部皮肤进行脱毛并消毒，在尿道上端1～2 cm处，沿腹部中线纵向切开皮肤及腹壁，暴露子宫，离卵巢1 cm处剪取2 cm长子宫，断端结扎。将所取子宫组织置于洛氏营养液中，剪取5 mm ×5 mm内膜固定并缝合在腹壁上。0.9%生理盐水冲洗移植处，缝合切口，常规饲养。7 d后随机挑选2只造模大鼠，开腹显示病灶处移植物体积增大，为直径5～8 mm的半透明囊肿，内有液体积聚，异位内膜有血管形成，提示造模成功。

1.3.2动物分组及给药将造模成功的大鼠随机分为模型组、阳性对照组及SFN低、中、高剂量组，每组8只；此外，设立空白对照(假手术)组，只进行开腹手术，不进行子宫剪切及内膜移植。利用0.9% NaCl溶液将SFN进行稀释，通过灌胃法对低、中、高剂量组大鼠每日分别给与5、10、15 mg/kg的SFN溶液。阳性药物组：给予0.5 mg/kg的孕三烯酮胶囊，每周2次。模型组及空白对照组：给与相同体积的0.9% NaCl溶液。各组均给药8周后处死大鼠，计算子宫内膜异位病灶体积和粘连评分[9]。

1.3.3 Real-time PCR检测Nrf2和HO-1的mRNA表达在无菌低温环境下将内膜组织剪碎，采用Trizol一步法提取组织总RNA。利用微量紫外分光光度计测定总RNA浓度，当A260nm/A280nm的值为1.8～2.2，表示提取的RNA合格。取1500 ng总RNA进行反转录，得到cDNA。引物序列由上海生物工程公司根据GenBank序列设计合成，以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，见表1。PCR反应条件：95 ℃变性30 s；95 ℃退火5 s；60 ℃延伸30 s；进行40次循环。反应结束获取循环阈值，分析实验数据。所有反应均设立3个复孔，双ΔCt法计算 mRNA的相对表达量。

表1 引物序列

1.3.4 Western Blot检测Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达取适量RIPA 裂解液匀浆内膜组织，12000 r/min 离心10 min，取上清液即为组织总蛋白溶液。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。各样品取20 μg蛋白，在10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中进行电泳分离，并将蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h。一抗在4℃下孵育PVDF膜过夜。洗涤后加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1:10000)室温孵育1 h，滴加适量的ECL底物液，孵育数分钟，使用凝胶图像分析系统观察，目的蛋白与内参蛋白光密度值之比作为目的蛋白的相对表达量。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

空白对照组术后4d活动逐渐恢复正常，毛色光亮，爪甲呈粉红色，舌头呈紫红色，饮食正常。而造模组术后活动量及进食减少，爪甲呈暗红色，舌头呈暗紫红色，毛色暗淡杂乱。

2.2 不同剂量SFN对大鼠病灶体积和粘连评分影响

相比于模型组，SFN 能有效抑制 EMs大鼠病灶体积和粘连评分，并呈剂量依赖趋势(P<0.05)。见表 2。

表2 各组中大鼠病灶体积和粘连评分比较

2.3 各组内膜组织中Nrf2和HO-1mRNA表达

模型组 Nrf2 和 HO-1 mRNA 表达水平均低于空白对照组(P<0.05)。与模型组相比，阳性对照组大鼠内膜组织 Nrf2 和 HO-1 mRNA的表达水平升高(P<0.01) ；此外，与模型组相比，低、中、高剂量SFN组中Nrf2 和 HO-1 mRNA的表达水平高于模型组(P<0.05)，并随药物浓度升高 Nrf2 和 HO-1 mRNA表达水平也随之上调。见表3。

表3 不同组别内膜组织中Nrf2 和HO-1mRNA的表达水平

2.4 各组内膜组织中Nrf2、Keap1和HO-1 蛋白表达

与空白对照组比较，模型组大鼠内膜组织中核蛋白Nrf2及Keap1、HO-1蛋白表达减少(P<0.05)；与模型组比较，低、中、高剂量SFN组中 Nrf2、Keap1和HO-1蛋白则呈浓度依赖式上调(P<0.05)。见表4。

表4 各组内膜组织中Nrf2、Keap1和HO-1 蛋白表达水平

从左至右依次是空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组

3 讨论

EMs是临床上常见的良性病变的妇科疾病，不仅有较高的发病率和复发率，而且有着如浸润生长、远处转移等恶性肿瘤的表现，具有一定的恶变率[10-12]。目前对于EMs的病因尚不明确，大多数学者认为其是在免疫、内分泌、遗传及内、外环境等多种因素的综合作用下发生发展[13-14]。临床上针对EMs的治疗主要包括手术治疗和药物治疗。手术治疗主要是直接切除EMs病灶，但这对卵巢储备功能存在影响且术后易复发[15]。药物治疗是通过避孕药和孕激素的联合口服，从而抑制内膜组织异常增生，但其不仅存在相关激素副作用，而且在用药期间也并没有解决患者的不孕问题[16]。因此，寻找治疗EMs的新药物成为亟待解决的问题。

研究表明氧化应激在促进EMs相关炎症介质(如细胞因子、活性氧、前列腺素等)的生成中起到了关键作用[17]。辛伐他汀、阿托伐他汀等抗氧化剂均能够显著减少EMs基质细胞的增殖，从而减少子宫内膜异位病灶[18-19]。SFN作为一种天然活性物质，与细胞内的多种信号通路都有相互作用，使其具有多种生理活性。其中较为重要的便是SFN可激活Nrf2信号通路[20]。Nrf2是一种与氧化应激及炎症相关的组织损伤中的氧化还原的敏感转录因子，广泛表达于全身各组织器官[21-23]。本实验将大鼠子宫内膜移植于腹壁建造自体内膜异位症模型，模拟临床上较常见的EMs。通过灌胃给药SFN，证明其确实对于EMs具有较好的治疗效果，使得模型大鼠病灶体积和粘连评分均显著降低。此外，SFN还可激活Nrf2/Keap1/HO-1信号通路，可明显刺激 Nrf2、HO-1 mRNA表达水平及使Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表达上调。抗氧化酶HO-1属于热休克蛋白家族，具有明显的抗炎抗氧化作用，可促进失衡的氧化还原反应恢复平衡，减轻自由基损伤[24-25]。

本实验证明SFN可能通过激活Nrf2/Keap1/HO-1信号通路，上调HO-1等抗氧化蛋白的表达而起到治疗EMs的效果。但本研究仅证明了SFN的作用与激活Nrf2/Keap1/HO-1信号通路有关，未能得到Nrf2/Keap1/HO-1信号通路参与EMs发生发展及SFN发挥治疗作用的直接证据，今后可进一步在动物及细胞水平上，使用SFN联合信号通路抑制剂验证该通路在SFN治疗EMs中的作用。