马铃薯早疫病拮抗细菌的筛选、鉴定及抑菌物质研究

于水清，杨毅清，张 岱，庞民好，杨志辉，朱杰华

(河北农业大学植物保护学院，河北 保定 071000)

【研究意义】马铃薯早疫病是由茄链格孢菌(Alternariasolani)引起的一种气传病害，是仅次于马铃薯晚疫病的第二大气传病害。在我国马铃薯生产中的危害程度日趋严重，平均每年发病面积约为90万公顷[1]。该病不仅可以为害马铃薯植株叶片，还可危害马铃薯茎秆和块茎[2]。目前，种植抗病品种是马铃薯早疫病的防治主要农业防治措施，但是由于马铃薯种薯退化严重、品种资源有限以及培育抗病品种时间长等因素[3]，导致马铃薯抗病品种选育和应用并不理想。化学农药作为当前病虫害防治的主要手段，见效快、成本低[4]，但长期大量使用化学农药，会导致病原菌抗药性、生态系统失衡和环境污染等问题。芽胞杆菌菌株及其代谢产物对植物病害有较好的防治效果，由于其抗逆性强，已成为生防菌剂的备选资源。生物防治因其具有与环境相容性好、对人畜和天敌安全等优点受到广泛关注，其中，生防菌的开发与应用是当今农业生产中防治植物病害的热点。【前人研究进展】近年来，利用芽胞杆菌防治茄链格孢菌时有报道。韩龙等[6]发现芽胞杆菌的单菌发酵液和混菌发酵液对茄链格孢菌均有抑制作用，其抑制率为62.12%～73.87%。杨继业[7]等分离得到解淀粉芽胞杆菌BAF-6对马铃薯早疫病菌的抑菌圈宽度为24 mm，且BAF-6发酵液具有良好的热稳定性和紫外稳定性，经蛋白酶处理后抑菌活性仍达50%以上。Umapathy等[8]发现解淀粉芽孢杆菌FZB24可有效提高马铃薯的防御酶，对马铃薯早疫病有较好的生防效果。【本研究切入点】目前，芽胞杆菌防治气传病害的报道较少，芽胞杆菌对于气传病害的作用机制尚不完善。【拟解决的关键问题】本研究从河北省承德市围场县马铃薯早疫病发生严重的马铃薯地块，定向分离生防菌株，并就其与马铃薯早疫病菌互作后的生物学表现进行研究，进一步明确其抑菌活性物质种类及抑菌机理。本研究旨在得到高效抑制马铃薯早疫病的生防菌株，以期为马铃薯早疫病的生物防治提供新的菌株资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 土壤样品的采集 2016年8月，于河北省承德市围场县连作5年马铃薯早疫病发生严重地块，用五点取样法取马铃薯植株根际土壤，装入无菌袋中，4 ℃保存备用。

1.1.2 供试病原菌 马铃薯早疫病菌Alternariasolani、苹果斑点落叶病菌A.alternarte、马铃薯枯萎病菌Fusariumsambucvnm、梨黑斑病菌A.alternate、马铃薯干腐病菌F.sambucinum、番茄灰霉病菌Botrytiscinerea、马铃薯黑痣病菌Rhizoctoniasolani、小麦根腐病菌Bipolarissorokiniana、小麦赤霉病菌F.graminearum。均由河北农业大学植物保护学院马铃薯病害研究中心提供。

1.1.3 培养基LB培养基 氯化钠10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、琼脂18 g/L；PDA培养基：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂18 g/L；TA培养基：番茄125 g/L，琼脂18 g/L。

1.2 试验方法

1.2.1 生防菌的分离与筛选 生防菌的分离采用土壤稀释法[9]，并结合平板对峙法对生防菌进行筛选。将马铃薯早疫病菌(直径5 mm)菌饼，接种于PDA培养皿中央，在距菌饼四周25 mm处放置5 mm滤纸片，接种5 μL生防菌发酵液。以接无菌水为对照，25 ℃培养7 d，测量抑菌圈宽度，每处理重复3次。

1.2.2 生防菌的鉴定 菌落形态观察，将生防菌液稀释涂布于LB平板上，37 ℃培养24 h，观察菌落形态、颜色、隆起形状和透明度。参照《伯杰氏系统分类手册》[10]和《常见细菌系统分类手册》[11]进行生理生化鉴定。

使用全氏金细菌基因组提取试剂盒提取生防菌株基因组DNA，采用gyrB-F(5’-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3’)与gyrB-R(TCCDCCSTAGARTCWCCCTC-3’)扩增gyrB基因[12]。将PCR产物送至上海生工生物工程有限公司完成测序，测序结果在NCBI数据库中进行 Blast 比对分析并用ClustalX 和MEGA 6.0软件构建基因树。

1.2.3 生防因子的测定 取1 μL活化的生防菌液，分别接种到酪蛋白培养基、含有1%的可溶性淀粉LB培养基、含有纤维素刚果红培养基和胶体几丁质酶培养基上，37 ℃培养48 h，观察有无透明圈产生，重复3次，拍照记录结果。

将过夜培养的生防菌接种在Ashby无氮培养皿中，以无菌水为对照，37 ℃培养2～4 d，连续培养3代，观察培养平皿中是否有菌落产生，重复3次，拍照记录结果。

取适量的大豆油和苏丹红染色剂混匀，向直径9 cm培养皿中加入适量无菌水，滴加染色后的大豆油。吸取少量生防菌液滴加到油膜中，观察是否形成排油圈，重复3次，拍照记录结果。

1.2.4 生防菌发酵液及脂肽粗提物抑菌谱的测定 发酵液抑菌谱测定：在培养基平皿中央放置直径5 mm的病原菌菌饼，四周25 mm处放直径6 mm的滤纸片。每个滤纸片上分别滴加5 μL菌株发酵液，以点接无菌水为对照，适宜温度培养至对照长满皿，测量抑菌带宽度。

脂肽粗提物抑菌谱测定：采用酸沉淀法[13]提取脂肽粗提物，在培养基平皿中央放置直径5 mm的病原菌菌饼，距中心25 mm处打孔，加入50 μL脂肽粗提物滤液，以加入50 μL甲醇为对照。适宜温度培养至对照长满皿，测量抑菌带宽度。

1.2.5 生防菌发酵液及脂肽粗提物对马铃薯早疫病菌丝的抑制作用 发酵液对茄链格孢菌丝的影响：将生防菌发酵液稀释至1×102、1×104、1×106、1×108cfu/mL。在距培养皿中心12.5 mm处分别接种马铃薯早疫病菌饼和5 μL菌株C16发酵液稀释液。以点接无菌水为对照，每个处理3次重复。25 ℃培养7 d，测量抑菌带宽度。

脂肽粗提物对马铃薯早疫病菌丝的影响：配制脂肽粗提物浓度分别为10、5、1、0.5、0.1 mg/mL。接种马铃薯早疫病菌饼于培养基中心，距中心25 mm处打孔，分别加入50 μL上述浓度脂肽提取滤液，以加入50 μL甲醇为对照，25 ℃培养7 d，分别测量抑菌带宽度。每个试验重复3次。

1.2.6 生防菌中脂肽类物质鉴定及活性成分测定 脂肽粗提物采用酸沉淀法提取。将脂肽粗提物进行高效液相色谱(HPLC)分析，采用C18柱(5 μm，250 by 4.6 mm；YYDAC218TP；Hesperia，CA)，流动相为乙腈、水、甲酸，流速为0.5 mL/min，紫外检测波长210 nm，柱温30 ℃，进样量为10 μL。以 Surfactin和Iturin纯品进样进行定性分析。

采用琼脂扩散法检测Surfactin、Iturin、Surfactin+Iturin 对茄链格孢菌丝的抑制作用。距离PDA培养基中心12.5 mm处接种活化后的5 mm马铃薯早疫病菌饼，对称位置打孔，分别加入50 μL 2.5 mg/mL Surfactin、Iturin以及Surfactin和Iturin混合液(体积比为1∶1)，以加入甲醇为对照，重复3次。

2 结果与分析

2.1 生防菌的分离与筛选

从5份土壤样品中共筛选得到对早疫病菌有抑制作用的拮抗菌74株，经筛选得到一株抑菌效果最为稳定、拮抗效果最好的生防菌，命名为C16，其对马铃薯早疫病菌的抑菌圈宽度可达31.5 mm(图1)。

1.对峙培养；2.对照

2.2 菌株C16的鉴定

菌株C16在LB培养基培养24 h后，形成近圆形、具有乳白色菌膜的菌落，表面有褶皱，四周有凸起中间略有凹陷。菌株C16形态呈短杆状，革兰氏染色阳性(图2)。

1.C16 菌落；2.革兰氏染色

菌株C16生理生化测定结果如表1所示，其生理生化指标符合《伯杰氏系统分类手册》和《常见细菌系统分类手册》中对芽胞杆菌属的描述。

表1 菌株C16的生理生化特征

以菌株C16的总DNA为模版，通过PCR获取gyrB基因片段，测序后将数据提交至GenBank数据库进行Blast比对结果显示，该菌株与多种芽胞杆菌Bacillus有较高的同源性，通过MEGA6.0构建最大简约法Maximum parsimony基因树(图3)，其中与贝莱斯芽胞杆菌(B.velezensis)同源性最高，故鉴定菌株C16为贝莱斯芽胞杆菌B.velezensis。

图3 MEGA 6.0构建菌株C16的基因树

2.3 菌株C16生防因子的测定

由图4所示，经碘液染色，菌株C16在含有淀粉的培养基培养，可看到明显的透明圈，说明该菌株可产生淀粉酶；菌株C16在无氮培养基上，能够继代生长，表明其具固氮能力；C16菌株可产生明显的排油圈，表明该菌株有产生表面活性素的能力。

1.蛋白酶；2.淀粉酶；3.纤维素酶；4.几丁质酶；5.固氮；6.排油圈

2.4 抑菌谱测定

如表2所示，菌株C16发酵液对马铃薯黑痣病菌、小麦根腐病菌、梨黑斑病菌、番茄灰霉病菌、苹果斑点落叶病菌、小麦赤霉病菌和马铃薯枯萎病菌等7种植物病原真菌均有显著拮抗效果(图5)，抑菌带宽度均在6 mm以上(表2)。菌株C16脂肽粗提物对马铃薯黑痣病菌、小麦根腐病菌、马铃薯干腐病菌、梨黑斑病菌和番茄灰霉病菌拮抗作用明显(图5)，抑菌带宽度均大于5 mm(表2)，由此可见菌株C16对植物真菌病害的防治具有广谱性。

1.苹果斑点落叶病菌；2.马铃薯枯萎病菌；3.梨黑斑病菌；4.马铃薯干腐病菌；5.番茄灰霉病菌；6.马铃薯黑痣病菌；7.小麦根腐病菌；8.小麦赤霉病菌

表2 菌株C16抑菌谱的测定

2.5 菌株C16发酵液和脂肽粗提物对早疫病菌丝的抑制作用

采用生长速率法测定菌株C16不同发酵液浓度对马铃薯早疫病菌的抑制作用。结果显示抑菌带宽度随菌株C16发酵液浓度增加而增加，当发酵液浓度为1×108cfu/mL时，抑菌带宽度最大，为9.67 mm(图6)。

随着菌株C16脂肽粗提物浓度的增加，其对马铃薯早疫病菌的抑制作用增加(图6)。当浓度为10 mg/mL时，抑菌带宽度为12.67 mm；当浓度为5 mg/mL时，抑菌带宽度为12.33 mm。选取5 mg/mL的脂肽粗提物作为后续试验浓度。

A.发酵液；B.脂肽粗体物

扫描电镜观察发现，对照组早疫病菌丝形态表面光滑，分支明显(图7-1)。经发酵液和脂肽粗提物处理后的菌丝畸形严重，菌丝出现变形扭曲(图7-2)，局部肿大形成泡囊(图7-3)，菌丝表面褶皱，胞质外泄(图7-4)。因此，发酵液对早疫病菌丝有致畸作用，其中脂肽粗提物为发酵液主要活性成分。

1.正常菌丝；2.菌丝变形；3.菌丝囊泡状畸形；4.菌丝表面褶皱

采用HPLC分析菌株C16脂肽类物质主要成分。菌株C16脂肽粗提物的洗脱峰分离时间为4.59～4.92 min，而纯品Iturin和Surfactin的分离时间分别为4.60～4.95和4.59～4.94 min。菌株C16发酵液和纯品Iturin和Surfactin的洗脱峰几乎重叠(图8)。表明菌株C16发酵液中含有Iturin和Surfactin两种物质。

图8 高效液相色谱法(HPLC)对菌株C16脂肽物质的鉴定

采用琼脂扩散法测定Iturin和Surfactin对马铃薯早疫病菌的抑制作用。如图9所示，Iturin对马铃薯早疫病菌的抑制效果最好；Iturin和Surfactin混合液(体积比1∶1)对马铃薯早疫病菌的抑制效果次之；Surfactin对马铃薯早疫病菌基本无抑制作用。表明Iturin为贝莱斯芽胞杆菌C16脂肽粗提物中主要抑菌活性成分。

1.表面活性素；2.伊枯草素；3.表面活性素+伊枯草素；4.甲醇；5.无菌水

3 讨 论

芽胞杆菌在空气、土壤、水等自然环境中广泛存在，绝大多数芽胞杆菌对人和环境友好。随着现代社会中有机农业、生态农业、绿色农产品等各种新兴理念的普及，人们对自身健康、环境安全、有害生物综合治理、农业可持续发展的关注度越来越高。作为一种较为理想的微生物资源，芽胞杆菌在生物防治研究中受到广泛关注。目前，利用芽胞杆菌防治早疫病已有一些报道。谢梓语等[14]研究发现108cfu/mL枯草芽胞杆菌B1409菌液对茄链格孢菌的预防效果和治疗效果分别为67.82%和41.22%。白彦丽等[15]发现多粘类芽胞杆菌F-152和Q-28菌液对茄链格孢菌的抑菌圈度高达19.95 和17.25 mm。本研究从马铃薯根际土壤分离得到贝莱斯芽胞杆菌C16，其菌液对马铃薯早疫病菌的抑菌圈为31.5 mm，抑菌活性强，生防能力优良。目前，对早疫病菌生物防治的研究多集中在菌株发酵液对病害的防治效果，然而关于脂肽粗提物对马铃薯早疫病菌的拮抗作用，以及相关活性物质的分析鉴定鲜见报道。本研究通过酸沉淀法提取脂肽粗提物，发现10 mg/mL的脂肽粗提物的抑菌带高达12.67 mm。明确了活性成分，对于今后开发应用该菌株具有重要意义。同时，研究发现的生防菌株具有很强的拮抗作用，表明其在生物防治马铃薯早疫病上具有广阔的应用前景。

抗生作用是芽胞杆菌拮抗植物病原真菌的主要机制之一[16]，芽胞杆菌通过分泌多种次级代谢产物抑制病原微生物的生长，从而达到生防目的[17]。脂肽类物质作为芽胞杆菌重要代谢产物，是生防菌拮抗植物病原真菌的主要活性物质[18]。脂肽类物质可造成菌丝畸形，从而抑制病原菌的生长[19]。赵雅等[20]采用酸沉淀法分离得到HN-Q-8菌株的甲醇粗提取物可以明显抑制马铃薯黑痣病菌的生长，使菌丝产生形态畸形扭曲，顶端弯曲等现象；王雨等[21]发现贝莱斯芽胞杆菌HN-2脂肽粗提物可以造成杧果炭疽病菌菌丝扭曲，末端膨大，对杧果果实具有较好的保护作用。本研究采用酸沉淀法对C16发酵液进行分离提取，得到脂肽粗提物，对马铃薯早疫病菌丝有明显致畸作用，可使菌丝表面褶皱，变形扭曲，局部肿大形成泡囊结构，这在一定程度上揭示了芽胞杆菌对马铃薯早疫病菌的拮抗机理。

芽胞杆菌分泌的脂肽类抗生素主要包括Iturin、Fengycin和Surfactin[22]，其生防功能已有报道。Iturins能抑制微菌核的萌发，诱导氧化、应激和丝裂原活化蛋白激酶的激活等，并介导植物的防御反应[23]；Fengycin主要拮抗丝状真菌，影响真菌细胞膜的表面张力，导致微孔形成，最终破坏细胞膜结构[24]；Surfactin能够插入到脂质双层，溶解流动的磷脂相，改变膜的渗透性[25]。本研究利用HPLC对脂肽粗提物中活性成分进行检测，根据保留时间可初步确定Surfactin和Iturin为C16脂肽粗提物中主要物质。通过琼脂扩散法分析两种物质对马铃薯早疫病菌的抑菌活性，结果表明Iturin对马铃薯早疫病菌有较强的抑菌活性。如需确定其化学结构，还需通过利用高效液相色谱或质谱等手段对Iturin进一步纯化及鉴定。

本研究分离得到的贝莱斯芽胞杆菌 C16 在马铃薯早疫病生物防治中具有开发利用潜力，但有关其生防机制和抑菌机理尚需进一步研究。

4 结 论

本研究筛选得到了一株对马铃薯早疫病菌有较强拮抗效果菌株，鉴定为贝莱斯芽胞杆菌，并命名为C16，其具有较广的抑菌谱。贝莱斯芽胞杆菌C16发酵液和脂肽粗提物均可显著抑制马铃薯早疫病菌丝的生长，可导致菌丝扭曲、变形，产生泡囊，其脂肽粗提物中主要抑菌物质为Iturin。