不同抗冻剂对西伯利亚鲟精子冷冻保存的影响

周 洲，李世凯，赵 飞，陈飞雄，孔 杰

(贵州省农业科学院 水产研究所，贵州 贵阳 550025)

【研究意义】精子超低温冷冻保存技术对物种遗传种质资源保护及苗种生产都具有重要价值。【前人研究进展】目前鱼类精子超低温冷冻保存研究已在日本鲟(Charybdisjaponica)[1]、褐鳟鱼(Caspianbrowntrout)[2]、花鲈(Lateolabraxmaculatus)[3]、虹鳟鱼(Oncorhynchusmykiss)[4]、大西洋鲑(Salmosalar)[5]、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)[6]、真鲷(Pagrosomusmajor)[7]等200多种海淡水鱼类中有报道。国内外对鲟鱼类精子冷冻保存技术开展较多研究的有中华鲟、西伯利亚鲟、史氏鲟、俄罗斯鲟等[8-11]。【本研究切入点】贵州自2012年实现鲟鱼全人工繁育以来，受到雌雄鱼性腺成熟不同步或地理分布不同产生的生殖隔离导致鲟鱼繁殖成功率不高。因此，有必要开展贵州鲟鱼精子冷冻保存研究，以提高人工繁殖技术及保存优质良种资源。抗冻剂是影响精子冷冻保存的重要因素[12-13]，但有关抗冻剂对贵州鲟鱼精子冷冻保存效果研究未见报道。【拟解决的关键问题】研究不同抗冻剂对西伯利亚鲟精子的冷冻保存效果，以期筛选出合适贵州鲟鱼精子的超低温冷冻保存抗冻剂。

1 材料与方法

1.1 精子采集及活力检测

1.1.1 精子采集 2019年4-5月，在贵州省水产研究所惠水养殖基地选取性腺发育成熟的鲟雄鱼[体长(1.42±0.25)m、体重(15.8±3.5)kg]进行人工催产。精子采集时用干净的干毛巾擦去体表和生殖孔周围的水分及污物，用生理盐水洗净的塑料软管轻轻插入生殖孔，用手轻轻挤压腹部使精液自然流出经导管流入干净干燥的50 mL离心管中，放置于4 ℃的冰盒中备用。

1.1.2 精子活力检测 用过滤井水稀释激活后的精子，在200倍显微镜下观察精子的运动情况，并通过计算机辅助精子分析系统采集相关数据。

1.2 配制精子抗冻剂

稀释液参照Glogowski等[14]的方法配制，配方为KCl 0.25 mmol/L、Tris-HCl 10 mmol/L、蔗糖23.4 mmol/L，pH调到8.5，将相关试剂定溶于1000 mL蒸馏水中，经过0.2 μm过滤除菌待用。然后用稀释液配置10%、15%及20%的甲醇(MeOH)、二甲基亚砜(DMSO)分别作为抗冻剂，所有试剂均为分析纯，试剂配好后放置在4 ℃的冰箱中备用。

1.3 不同抗冻剂处理鲟鱼精子活力的测定

将1 mL活力好的鲟鱼精液加入冻存管中，以1∶1的比例加入配制好的抗冻剂，使精子的浓度稀释1倍，混匀后将冻存管放置于4 ℃冰箱平衡20 min后进行液氮冷冻(首先将装有冻存管的冻存盒置于液氮面以上6 cm处平衡10 min，之后在液氮面2 cm处平衡5 min，最后直接投入液氮中)。解冻时先将其从冻存盒中取出，迅速放入37 ℃水浴锅中摇晃解冻，至冻存管中没有小冰块时停止解冻。用纸巾将冻存管表面的水分擦干，然后用牙签蘸取少量精液于载玻片上，用吸管滴入1滴过滤井水涂匀，迅速在显微镜下(200×)观察精子的活力，利用计算机辅助精子分析系统(computer-aided sperm analysis, CASA)测定鲟鱼鲜精液活力，筛选精子活力高的抗冻剂。精子活力根据直线运动速度分为4个级别：A级精子的直线运动速度大于25 μm/s，B级精子的直线运动速度大于15 μm/s，C级精子的直线运动速度大于5 μm/s，D级精子的直线运动速度为0～5 μm/s。

1.4 不同抗冻剂处理鲟鱼精子运动参数的测定

不同抗冻剂冻存的精子经解冻后，用牙签分别蘸取少量精液于载玻片上，用吸管滴入1滴过滤井水涂匀后，利用计算机辅助精子分析系统分别检测精子的运动参数，主要包括平均曲线运动速度(curvilinear velocity, VCL)、平均直线运动速度(straight line velocity, VSL)、平均路径速度(average path velocity, VAP)、精子头侧摆幅度(amplitude of lateral head displacement, ALH)、运动的直线性(linearity, LIN)、运动的摆动性(wobble, WOB)、运动的前向性(straightness, STR)、精子平均鞭打频率(beat cross frequency, BCF)及平均移动角度(motion average degree，MAD)。同时测定鲟鱼鲜精液的运动参数。

1.5 数据处理

利用SPSS19.0对试验数据进行处理，数据用平均值±标准差表示，采用单因素方差分析检验各试验组精子活力的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 鲟鱼精子的活力

从表1看出，鲟鱼鲜精A+B级活力精子占93.04%，其中A级精子占58.50%。浓度为10%、15%及20% MeOH保存的精子解冻后，A级活力精子占比均为0，B级低于5%，C级在9.34%～13.91%，而D级最高，在80.78%～88.39%；整体比较，以15% MeOH保存的精子活力较高。浓度为10% DMSO保存的精子解冻后，D级活力精子占比最高，为60.2%，其次是C级，为35.13%,B级仅占4.67%，而A级活力精子占比为0；浓度为15% DMSO保存的精子解冻后，D级活力精子占比最高，为30.26%，A级和C级相差不大，分别为25.37%和24.91%,B级最低，为19.46%；浓度为20% DMSO保存的精子解冻后，D级活力精子占比最高，为43.14%，其次是C级，为27.45%，A级居第3，B级最低，仅占9.8%；整体比较，以15% DMSO保存的精子活力较高。2种抗冻剂相比，不同浓度MeOH保存的A+B级活力精子仅占0～5.31%，平均3.62%；15%DMSO保存的A+B级活力精子占4.67%～44.83%，平均26.30%。表明，DMSO保存的精子活力远高于MeOH保存的精子。

表1 2种抗冻剂不同浓度处理精子不同活力等级占比

2.2 鲟鱼精子的运动参数

从表2看出，不同抗冻剂处理中，鲟鱼精子的运动参数DMSO显著或极显著高于MeOH。DMSO不同浓度处理中，10%DMSO处理鲟鱼精子的运动参数各指标均显著低于15%DMSO处理和20%DMSO处理。运动参数各指标中，VCL、VSL、VAP、BCF和MAD均以15%DMSO处理最高，分别为24.33 μm/s、13.48 μm/s、22.16 μm/s、12.03 Hz和22.92°，差异均不显著；ALH、LIN、WOB和SRT均以20%DMSO处理最高，分别为4.09 μm、61.56%、92.31%和66.69%、高于处理，而则低于20%DMSO处理，但差异均不显著。综合比较2种抗冻剂处理精子的运动参数，以15%DMSO处理的效果较好。

表2 2种抗冻剂不同浓度处理精子的运动参数

3 讨 论

精子的运动特性是判断精液质量的综合指标，与其受精能力密切相关，在鱼类的生产应用及生殖研究方面具有重要的意义。而由于鱼类精子激活后运动速度较快，且持续时间不长，使得常规检测方法误差较大，计算机辅助精子分析系统(CASA)是建立在显微摄像基础上的计算机精子运动图像处理的自动分析系统[15-16]，此系统能够快速准确地测定精子的密度、活率、活力等运动参数，可避免传统的显微观察分析方法因检测者的个人主观因素造成检测结果的误差，重复性好。如柳凌等[17]利用计算机辅助分析几种鲟鱼冻精激活液对精子活力参数的影响；刘清华等[18]运用计算机辅助分析检测超低温保存的真鲷精子质量。本实验通过计算机辅助分析对西伯利亚鲟鱼鲜精及几种不同抗冻剂保存后的精子运动参数进行测定。

鲟鱼鲜精经过滤井水激活后，精子的寿命仅有100s左右，且随着时间的延长，鲟鱼精子的运动速度逐渐变慢，这和胡家会等[19]研究文昌鱼精子的运动特征相类似。鲟鱼鲜精的VCL为30.31 μm/s,VSL为13.08 μm/s，这与柳凌等[17]利用计算机辅助对西伯利亚鲟冻精激活(10 mmol/L Tris)后精子的VCL为112.96 μm/s,VSL为65.61 μm/s有较大差异[17]，这在一定程度上解释了实验所在苗种基地鲟鱼人工繁育试验受精率长期维持在50%左右的原因，因为精子运动速度的快慢直接影响精子的受精率，速度小则减少了精子与卵子接触的机会。

抗冻剂MeOH 和DMSO被广泛应用于鱼类精子的超低温冷冻保存中[1-7,20]。在已经报道的鲟鱼精子保存研究中，MeOH 和DMSO都可以作为抗冻剂，但是从精子解冻后的活力来看，MeOH要比DMSO好[8,11]。研究结果表明，3种浓度的MeOH抗冻剂精子激活后A级精子均为0，且A+B级精子最高占比仅5.31%。3种浓度的DMSO抗冻剂精子解冻激活后，15%DMSO组A+B级精子占比为44.83%，效果最好。本实验测定精子的9项运动参数，根据研究报道在鲤鱼(Cyprinuscarpio)[22]、文昌鱼(Branchiostomabelcheritsingtauensis)[19]、湖鲟(Acipenserfulvescens)[22]及大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[23]等鱼类中最重要的精子运动参数为VCL和VSL，15%DMSO组精子的VCL和VSL组均大于其他两组。同时，15%DMSO组精子的VSL/VCL值为55.40%，大于20%DMSO组精子的VSL/VCL值46.48%，由于VSL/VCL是精子运动轨迹弯曲程度的最好体现，与精子受精率呈正相关[24]，这也说明了几种抗冻剂保存效果较好的为15%DMSO。抗冻剂DMSO的效果优于MeOH，一方面这可能与贵州自1999年引进鲟鱼亲本已有20年的培育，长期的地理隔离或者培育方式造成精子抗冻剂的不同；另一方面鱼类精子超低温冷冻保存研究与精子的稀释液、解冻后激活液的成分等因素有关，下一步将对西伯利亚鲟精子超低温精子保存的条件进一步优化，并开展超低温保存精子解冻后的受精率的研究。

4 结 论

浓度为10%、15%、20%MeOH作为抗冻剂，精子解冻激活后A级精子活力占比均为0，B级在2.27%～5.31%，C级在9.34%～13.91%,D级在80.78%～88.39%；浓度为10%、15%、20% DMSO作为抗冻剂，精子解冻激活后A级精子占比在0%～25.37%，B级在4.67%～19.46%，C级在24.91%～35.13%，D级在30.26%～60.20%，其中15%DMSO处理组中A级精子占比最高，为25.37%。不同抗冻剂处理中，鲟鱼精子的运动参数DMSO显著高于MeOH，10%DMSO处理组鲟鱼精子的运动参数各指标均显著低于15%DMSO处理和20%DMSO处理，15%DMSO处理和20%DMSO处理间差异不显著。综上，西伯利亚鲟的精子超低温冷冻保存抗冻剂以15%DMSO的抗冻效果最好。