Kisspeptin10对初情期前雌性小鼠生殖的影响及作用机制

梅 山，杨 丽，史远刚，淡新刚*

(1.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏医科大学 实验动物中心，宁夏 银川 750004)

【研究意义】滩羊是宁夏及毗邻地区独特的绵羊种质资源，其肉质和皮毛知名度较高。然而滩羊最大的问题在于繁殖力低下，这不仅因为它是单胎动物，更重要的是，它是典型的季节性繁殖动物。因此，在乏情季节促进滩羊发情、排卵是提高其繁殖力重要手段。【前人研究进展】Kisspeptin(KP)，一种kiss1基因的产物，它是调控GnRH释放的主要因子。Kiss1基因编码145个氨基酸，在体内进一步被加工、剪切成各种不同长度的有生物活性的多肽(命名为kisspeptin54，kisspeptin14，kisspeptin 13，kisspeptin10)，所有这些肽在其C末端都拥有10个氨基酸的基序，并且在不同种属间显示出相当高的保守性[1]。脑室内或外周注射各种类型的KP都能促进FSH和LH的释放。除了在下丘脑表达外，kiss1和kiss1R也在小鼠[2]、大鼠[3]、绵羊[4]、恒河猴[5]等动物的腺垂体中表达。Kisspeptin10能够诱导FHSβ、LHβ基因的表达[2]，kisspeptin10能够刺激体外培养的恒河猴腺垂体细胞LH和GH的释放[5]。

另外，kiss1及kiss1R也在性腺当中表达，它可能以旁分泌或自分泌的方式直接调控配子的发生。大量的动物实验结果已经表明，外周注射不同类型的KP均能提高成年动物体内促性腺激素水平。成年雌性大鼠皮下注射或静脉注射kisspeptin10能够提高血浆FSH和LH的浓度[6]。给间情期的狗静脉注射一剂kisspeptin10能够以剂量依赖的方式(1～30 μg/kg)提高血浆中FSH、LH及雌激素的浓度[7]。以上这些结果都表明外周注射KP，能够提高成年动物血浆中促性腺激素水平，能够激发性腺活力。然而，KP对初情期前动物的影响还研究的比较少，KP处理是否能够提前启动动物的初情期，能否能够激活动物的繁殖轴尚未清楚。【本研究切入点】本研究用kisspeptin10处理性成熟前的雌性小鼠，明确kisspeptin10对性成熟前小鼠生殖及生殖内分泌的影响，并阐明其初步的作用机制。【拟解决的关键问题】此研究以期为下一步研发滩羊非发情季节繁殖新技术提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品

Kisspeptin10多肽(Phoenixbiotech，048-56)，动物组织总RNA提取试剂盒(TIANGEN，DP431)，Talent qPCR PreMix(TIANGEN，FP209-02)，Ttrizol(Invitrogen，15596026)。

1.2 试验动物

2周龄ICR雌性小鼠80只，饲养于宁夏医科大学试验动物中心，按照中心标准进行饲养、管理。称重、预饲养1周后2次称重，挑选出32只体重和生长速度趋于一致的32只小鼠用于后期试验。

1.3 试验方法

试验小鼠随机分为4组，每组8只。试验组分别每天上午8：00及晚上8：00皮下注射150 μL含不同浓度kisspeptin10(0.3、3、30 μg)的生理盐水，并以注射150 μL生理盐水作为对照组，连续注射7 d，在注射结束后第2天观察记录小鼠阴道口开张情况；眼眶采血，血液置于肝素钠包被的1.5 mL离心管中，2000 r/min，离心8 min，分离血浆后置于-20 ℃保存；随后，每一组小鼠采集垂体后分别置于含有1 mL Trizol的冷冻管中，然后立即置于液氮冷却，最后放于-80 ℃冰箱保存；同时，分离小鼠两侧卵巢称重，用游标卡尺测定卵巢直径并记录。

1.4 小鼠垂体组织总RNA的提取，反转录及荧光定量

将上述垂体组织室温解冻，并用试剂盒自带一次性研磨杵进行研磨，然后用trizol法提取垂体总RNA；反转录成cDNA，设计引物(表1)对垂体GnRH-R、FSHβ、LHβ基因进行荧光定量PCR检测。扩增条件为：94 ℃预变性5 min，98 ℃变性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，总共35个循环。

表1 GnRH-R、FSHβ、LHβ基因的荧光定量引物

1.5 RIA法检测生殖激素浓度

试验小鼠外周血中FSH及LH浓度委托北京华英生物技术研究所进行激素RIA测定。

1.6 统计分析

所有数据用平均值±标准差表示(M+SD)，运用SPSS20.0进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 垂体总RNA浓度与质量检测

图1显示，4组小鼠总RNA提取后测得核酸浓度分别为196、253、186、228 ng/mL，且OD260/OD280均在1.6～2.1，表明所提取的RNA无污染且RNA浓度可满足后续试验要求。RNA电泳后发现对照组的(1泳道)、0.3 μg Kp处理组(2泳道)、3 μg KP处理组(3泳道)及30 μg KP处理组中所提取的小鼠垂体RNA完整、无降解。

图1 RNA电泳图

2.2 Kisspeptin处理对小鼠卵巢直径、质量及小鼠阴道开张的影响

由表2可见，KP处理初情期前的小鼠后能够增加卵巢的平均质量和直径，皮下注射3 μg KP和30 μg KP均能显著增加小鼠卵巢质量和卵巢直径(P<0.05)，且前者对卵巢的增重效果优于后者，注射0.3 μg KP无论是对小鼠卵巢的重质量还是卵巢直径无显著影响；在经KP连续处理后，3 μg KP能够显著提高小鼠阴道开张率(P<0.05)，而其它浓度的KP均不能明显促进小鼠的阴道开张。

表2 不同浓度KP处理初情期前小鼠后对其卵巢质量、直径及阴道开张的影响

2.3 Kisspeptin处理初情期前小鼠外周血中生殖激素浓度变化

由图2显示，初情期前的小鼠经KP连续处理一周后，与对照组相比，3 μg KP处理组中小鼠外周血中LH的浓度显著增加(P<0.05)，而其它浓度的KP均不能明显改变LH的浓度；与对照组相比，3 μg KP处理均能显著提高小鼠外周血中FSH浓度(P<0.05)，而0.3 μg KP处理却显著降低血中FSH的浓度，30 μg KP处理对小鼠血中FSH浓度无显著改变。

图2 不同浓度的KP处理初情期前的小鼠后外周血中FSH和LH浓度变化

2.4 Kisspeptin处理初情期前小鼠后垂体相关基因表达

由图3显示，3 μg KP处理能够显著上调小鼠垂体中GnRH-R、FSHβ及LHβ基因表达(P<0.05)；而其它浓度KP对小鼠垂体GnRH-R、FSHβ及LHβ基因表达是复杂的，30 μg KP能显著降低GnRH-R、FSHβ基因表达，而显著上调LHβ基因的表达。另外，0.3 μg KP能够显著降低FSHβ及LHβ基因表达(P<0.05)。

图3 KP处理对初情期前小鼠垂体相关基因表达的影响

3 讨 论

下丘脑GnRH脉冲性释放的频率和幅度均增加是动物初情期启动的标志，然而人们一直对调控GnRH释放的上游因子知之甚少。在过去十多年的研究已经明确KP是刺激GnRH释放最重要的因子，诸多研究已经表明完整的KP信号通路对哺乳动物初情期启动是必须的，尤其是内齿类和人类[8]。在人上kiss1或kiss1R基因突变会导致青春期异常或缺乏青春期[9]。本研究发现，初情期前的小鼠经过连续一周皮下注射0.3 μg kisspeptin10能够明显的提高小鼠阴道开张率，提前启动小鼠的初情期。Daniel等[10]在给出生后21 d雌性大鼠脑室内连续注射KP受体的拮抗剂P234 14 d，结果发现能够延后大鼠初情期的启动。Decourt等[11]给初情期前的小鼠每天注射合成的KP的类似物C6，连续5 d能够明显使其阴道开张提前。这些结果均与本实验结果相符，这也进一步证实了KP与哺乳动物初情期启动关系密切。Wassie等[12]使用重组的裸质粒pVAX-Kisspeptin-54-S-asd 疫苗免疫8周龄雄性羔羊后，检测发现内源性KP浓度显著下降，并且与对照组相比，免疫组羔羊睾丸重量、睾丸的长度和宽度明显小于对照组的。结果也表明0.3 μg KP处理初情期前的小鼠后，其无论是卵巢质量还是卵巢直径均显著增加，这也说明KP在初情期前动物生殖器官的发育中也可能起到非常重要的作用。而这种机制可能是KP作用于下丘脑-垂体刺激促性腺激素释放，进而间接促进初情期之前动物的生殖道进一步发育，但是也不能排除KP可能直接作用于卵巢，促进其生长发育并激活卵巢功能。

已有研究表明，初情期前的大鼠皮下注射6.7 nmol metastin(kisspeptin54)不但能够明显增加外周血中FSH和LH的浓度，而且在PMSG预处理后能够诱导其排卵[13]。Navarro等[14]给初情期前和成年雌性大鼠脑室内注射或者外周注射(皮下或静脉注射)kisspeptin10均可显著增加血浆中FSH和LH浓度。Macedo等[15]使用牛kisspepin10处理初情期之前的小母牛，发现kisspepin10能够以剂量依赖的方式增加其外周血中LH的浓度。我们的研究也发现，皮下注射一定浓度的kisspeptin10能够显著增加初情期前小鼠外周血中FSH和LH的浓度。然而，这些生殖激素浓度的增加与KP浓度之间并无剂量依赖关系，推测可能与KP在高浓度时发生了脱敏反应有关[16]。另外，低剂量的KP对小鼠垂体LH的分泌作用不显著，但却能够显著降低外周血中FSH浓度，其具体原因尚不清楚。

本结果也显示，0.3 μg KP处理初情期前的大鼠可显著上调垂体中FSHβ及LHβ基因的表达，而这种上调可能通过两个方面进行的。其一可能是KP直接作用于垂体促性腺细胞，并与之受体结合上调FSHβ及LHβ基因的表达。Zmijewska等[17]在体外培养的猪垂体前叶细胞中发现，KP能够上调LHβ基因的表达，增加细胞LH的分泌。Witham等[18]在培养的原代小鼠腺垂体细胞和LβT2促性腺细胞系中均发现，添加KP可诱导FSHβ及LHβmRNA的表达。这些都与本试验结果一致。其二，可能KP与垂体前叶中GnRH-R相互作用，通过增加GnRH-R受体量来介导GnRH促进FSHβ及LHβ基因的表达，从而增加垂体前叶促性腺激素的合成和释放。试验结果发现，皮下注射适宜浓度的KP能够显著上调小鼠腺垂体中GnRH-R mRNA的表达。Mijiddorj等[19]也证实GnRH和KP可以在垂体上相互作用，KP可以上调垂体前叶促性腺细胞中GnRH-R基因的表达，从而调控垂体促性腺激素的释放。

4 结 论

本研究发现，一定浓度KP连续处理初情期前小鼠可增加小鼠卵巢平均重量和直径，提高小鼠阴道开张率，提前启动初情期；KP可能直接上调垂体前叶细胞中FSHβ及LHβ的表达或者通过间接上调GnRH-R mRNA的表达来增加初情期前小鼠外周血中促性腺激素浓度。然而，具体的分子机制还需做进一步研究。