黄颡鱼源铜绿假单胞菌PA-5的分离及其对寄主抗菌肽基因的影响

阎 华，王 会，汤尚文，于 博，黄升谋，李云捷，吴进菊，李玉奇

(1.湖北文理学院食品科学技术学院，湖北 襄阳 441053；2.湖北省食品配料工程技术研究中心，湖北 襄阳 441053；3.襄阳市中心医院，湖北 襄阳 441053)

【研究意义】黄颡鱼属于辐鳍鱼纲，鲇形目，鲿科，是一种常见的淡水鱼，是食用鱼中经济价值较高的鱼类。其养殖分布广，产量高，运动力强。肉嫩，味美，少刺多脂。湖北省汉川市已经具有相当规模的黄颡鱼养殖产业，并在不断地扩大[1]。但是当地黄颡鱼养殖户为了追求更多经济效益，在其养殖过程中采用过度密度养殖，并且投食高蛋白饲料，引发黄颡鱼生长水环境急剧恶化。而且许多养殖户忽视了黄颡鱼预防疾病措施，导致其传染性疾病趋向严重，发病率有的养殖场可以达到75%以上，造成大量鱼体死亡，经济效益受损[2]。在2019年6-9月，湖北省汉川市的几个养殖场同时爆发黄颡鱼疾病，均表现为体表溃疡，鱼体口鼻充血、流血，对鱼体解剖，明显发现肝脏、脾脏、肾脏肿大，并伴有血斑。本研究室对其病原菌分离鉴定后发现，是属于铜绿假单胞菌的急性感染。铜绿假单胞菌广泛存在于自然界，是一种革兰氏阴性菌，是水产养殖主要的条件致病菌。铜绿假单胞菌感染黄颡鱼后，会导致寄主产生腹水病、腐皮病以及败血症。铜绿假单胞菌的溶血性毒素致病力强，可以引发寄主细胞膜裂解[3]。该病原菌也可以引发人体产生疾病，可以引起皮肤病，肠炎病和呼吸道疾病，属于人兽共患病原菌。鱼体的抗菌肽在其免疫系统中防御病原体发挥着重要的作用，众多科学家发现，抗菌肽特征为强碱性、对热较为稳定和具有广谱抗菌性能等[4]。鱼体内发育成熟的抗菌肽可以抵抗外界细菌和真菌的感染。【前人研究进展】前人研究发现，抗菌肽的作用机制是结合到细菌或者真菌的细胞膜，引发细胞膜形成跨膜离子通道，使得细菌或者真菌细胞内容物破裂，引发细菌或者真菌死亡。不同鱼类生物的抗菌肽种类不尽相同，产生的位置也相同，但是大部分存在于肝脏，肾脏，皮肤、胃黏膜和小肠细胞等部位。抗菌肽Piscidin拥有25个氨基酸，是双亲性a螺旋构造，不同种类抗菌肽氨基酸序列比对表明其序列同源性不是很高。该族抗菌肽基因结构大致相同，一般存在4个外显子和3个内含子。但是罗非鱼和石斑鱼等，也存在不同的基因结构，其他形式的基因结构，如3个外显子和2个内含子或者 5个外显子和4个内含子等结构[5]。陈大玮等研究了棕点石斑鱼的抗菌肽piscidin，并在原核生物中克隆和表达。抗菌肽Piscidin在鱼体的不同部位可以形成不同的异构体，主要表达部位为肝脏，肾脏，鳃、皮肤和肠[6]。多种外界刺激病原体，如G+、G-细菌，病毒、寄生虫等，均可诱导鱼体生物的抗菌肽piscidin抗菌肽的特异性表达。迄今发现，抗菌肽piscidin具有广谱抗菌性，尤其对链球菌、假单胞菌、弧菌等具有良好效果[7]。【本研究切入点】本研究对湖北省汉川市同旺养殖场患病黄颡鱼的病原菌进行分离鉴定，在此基础上，健康黄颡鱼腹腔注射该病原菌，铜绿假单胞菌PA-5感染以后，采用实时荧光定量PCR的技术探讨菌肽基因PC1/PC2/PC3在黄颡鱼肝脏，肾脏以及表皮组织中的不同表达特征。【拟解决的关键问题】此研究为分析黄颡鱼抗菌肽在对抗细菌性感染产生和变化的机理提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验仪器和试剂

HZP-25型恒温振荡培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)、BKQ-B50型全自动高压蒸汽灭菌锅(济南来宝医疗器械有限公司)、KENTON-101型电热鼓风干燥箱(上海康恒科学仪器有限公司)、SJ-56型超净工作台(苏州洁净设备有限公司)、T3型紫外可见分光光度计(上海一铺仪器有限公司)、VITEK-32型全自动微生物分析鉴定仪(梅里埃公司)、RE-200型低温冰箱(青岛海尔电器有限公司)、麦康凯琼脂培养基、LB 培养基和生理盐水，DNA提取试剂盒(北京华康生物技术有限公司)。PCR反应试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。MINIAMP-1型PCR仪器(美国贝登仪器公司)。DNA分子量标准物(上海启发试验试剂有限公司)。Trizol试剂盒(北京赛英生物科技有限公司)。反转录试剂盒(北京兴东生物工程公司)。SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。BTK-3型荧光定量PCR仪(无锡百泰克生物技术有限公司)。

1.2 黄颡鱼致病菌的分离与鉴定

1.2.1 患病黄颡鱼的获取及其致病菌的分离 患病黄颡鱼从湖北省汉川市同旺养殖场获得，具有典型败血症特征，主要表现为鱼体反应迟钝，摄食少或者不摄食，口鼻充血，皮肤表面有斑点出血。对这些患病黄颡鱼解剖后，发现其肝脏和肾脏肿大，有点状出血，肠道部位也有充血。实验室无菌条件下解剖发病黄颡鱼，挑取出肝脏后，用无菌研钵快速匀浆。然后把匀浆稀释成不同倍数，分别移液取用匀浆10 mL，均匀涂布到麦康凯琼脂平板上，30 ℃恒温培养24 h，肉眼观察菌落生长形态。挑取优势菌群菌落，进行划线培养，培养数次后，挑取菌落形态较为一致单菌落进行低温保藏，作为后续试验用菌株。

1.2.2 致病菌菌株的生理生化鉴定 革兰氏染色是在实验室无菌条件下开展，将菌株用接种环均匀涂布到滴有生理盐水的载玻片上，高温干燥后使用酒精灯固定，固定后放置结晶紫染液中初染1 min，而后在碘液中染色1 min，随后滴加乙醇溶液进行脱色30 s，直到载玻片表面无紫色液体，最后在番红染液中染色1 min，干燥后使用显微镜进行观察。生理生化特征使用VITEK-32全自动微生物分析鉴定仪进行操作，革兰阴性菌鉴定板进行操作，试验完成后进行结果分析。

1.2.3 致病菌菌株的分子生物学鉴定 致病菌菌株DNA的制备按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。致病菌菌株多重PCR包括两对引物(大连宝生物工程有限公司)，具体见表1。PCR反应体系(25 μL)：10.0 μLTaqmaster mixture，0.8 μL gyrB引物，0.5 μL 16srRNA引物和1.0 μL提取DNA，余量为ddH2O[8]。PCR扩增过程：预变性92 ℃，5 min。93 ℃，30 s，58 ℃，45 s，70 ℃，30 s，循环30周期。最后70 ℃，延伸10 min。扩增完成的DNA片段取用8.0 μL 放置在2%琼脂糖凝胶上水平电泳，电泳过程中加入1×TAE缓冲液(0.04 mol/L Tris，0.02 mol/L醋酸，0.002 mol/L Na2EDTA)，电泳电压100 V，电泳时间45 min。电泳完成后使用1 μL溴化乙锭染色30 min，紫外灯进行拍照。基因大小比对标准品是100个碱基对DNA梯度标记物。扩增完成的DNA片段经过纯化连接入pMD18-T载体，挑选阳性克隆进行碱基序列测序。

表1 致病菌菌株鉴定所用引物序列和目标基因

1.3 铜绿假单胞菌PA-5侵染健康黄颡鱼后其抗菌肽基因的表达影响

1.3.1 健康黄颡鱼的获取 从华中农业大学水产研究院购买外观健康、大小较为一致的黄颡鱼，鱼体质量大约为(150±5)g、体长大约为(30±1)cm。鱼塘养殖1周后，饮食均正常的鱼体进行接种试验，试验鱼随机分配，产生两个处理组：试验组和对照组，每组均设3个平行，每个平行50尾，共计300尾。

1.3.2 黄颡鱼的病原菌侵染和样品收集 根据预试验，铜绿假单胞菌PA-5感染黄颡鱼的最适菌悬液浓度为3.0×106cfu/mL。将恒温培养获得的铜绿假单胞菌PA-5以0.65%无菌生理盐水进行洗脱，并稀释为3.0×106cfu/mL。采用黄颡鱼腹腔注射方式，注射前鱼体用100 mg/L丁香酚局部麻醉，试验组每尾注入0.2 mL菌悬液，对照组注入0.2 mL无菌生理盐水。注射完成后0，12，24，36，48，60，72，84，96 h，各个时间点各个平行取3尾鱼，解剖后收集鱼体肝脏，肾脏和表皮组织。置于-80 ℃ 液氮中保存，作为后续抗菌肽基因的表达影响研究样品。

1.3.3 样品的RNA提取及cDNA的反转录合成 解冻后的肝脏，肾脏和表皮组织使用 Trizol试剂盒，按照说明书方法提取总RNA。提取获得的RNA使用1%琼脂糖凝胶水平电泳检测其总RNA的纯度，紫外灯下观察总RNA浓度。然后使用反转录试剂盒，按照说明书方法进行反转录，样品总RNA溶液加入0.5 μL DNA-Eraser，随后加入反转录复合物和引物2.0 μL，用ddH2O补足反应溶液10.0 μL，反转录反应条件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。反转录后的cDNA样品4 ℃保存，作为后续研究样品。

1.3.4 实时荧光定量PCR分析 实时荧光定量PCR分析是使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，按照产品说明书方法进行操作，引物(大连宝生物工程有限公司)具体见表2。qPCR反应溶液(25.0 μL)：SYBR Green PCR Mix溶液 12.5 μL，PC1/PC2/PC3引物溶液(10 μmol/L)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，余量为双蒸水。扩增条件为：预变性，95 ℃，30 s。95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，循环40周期；60 ℃下实时采集反应体系中的荧光信号。

表2 黄颡鱼抗菌肽相关基因实时荧光定量PCR所使用的引物

1.4 数据统计

所有数据均为平均值±标准差。根据二分法进行统计，目的基因的相对表达量差异采用SPSS18.0软件进行分析[9]，并使用t检验法对其差异进行显著性分析，P<0.05代表差异显著。

2 结果与分析

2.1 致病菌菌落形态和菌株特征

采用划线纯化平板培养的方法从患病黄颡鱼的肝脏样品分离得到1株菌落形态较为一致的菌株，命名为PA-5。麦康凯琼脂培养基上30 ℃培养24 h后，菌落呈圆形，边缘较为光滑湿润，中央稍微隆起，半透明，灰绿色具体见图1-A。革兰氏染色后PA-5为革兰氏阴性细菌，显微镜观察为红色，长棒状直的或者弯的杆菌，长度约2.0 μm，宽度约0.6 μm，细胞分散，单个存在，可以运动，具体见图1-B。

图1 患病黄颡鱼的肝脏中分离的致病菌PA-5菌落形态(A)和菌株特征(B)

2.2 致病菌菌株的生理生化鉴定

致病菌菌株PA-5，使用VITEK-32 全自动微生物分析鉴定仪，革兰氏阴性鉴定板进行操作，其对葡萄糖，伯胶糖，单奶糖和甘露糖灵敏，产酸不产气，表明该菌株能够利用这些物质，合成体内所需物质。对麦芽糖，葡聚糖，棉子糖，乳糖和蔗糖钝化，产气不产酸，表明该菌株不能够利用这些物质，不能够合成体内所需物质。综合生理生化特性，鉴定结果为铜绿假单胞菌，生理和生化特性具体见表3。

表3 致病菌株PA-5生理生化特性

2.3 致病菌菌株的分子生物学鉴定

如图2所示，使用多重PCR技术进行操作后，证实患病黄颡鱼分离得到的致病菌PA-5携带有969 bp的gyrB基因，同时携带有1380 bp的16srRNA基因。将测序完成的DNA片段经过基因序列比对，该菌与NCBI数据库中的铜绿假单胞菌的亲缘关系最为接近，因此鉴定致病菌PA-5为铜绿假单胞菌。

M：DNA标准品，1：致病菌PA-5，2：肝脏感染菌

2.4 铜绿假单胞菌PA-5侵染健康黄颡鱼PC1抗菌肽基因表达的影响

黄颡鱼腹腔注射铜绿假单胞菌PA-5后，PC1抗菌肽基因在肝脏组织的表达量相对于0 h均出现不同程度上调，其中24,36与 差异显著(P<0.05)，感染后24 h表达量最高(图3-1)。PC1抗菌肽基因在肾脏组织的表达量相对于0 h均出现不同程度上调，其中24,36与0 h差异显著(P<0.05)，感染后24 h表达量最高(图3-2)。PC1抗菌肽基因在表皮组织的表达量相对于0 h均出现不同程度上调，其中36,48与0 h差异显著(P<0.05)，感染后36 h表达量最高(图3-3)。

* 显著性差异(P<0.05)，下同

2.5 铜绿假单胞菌PA-5侵染健康黄颡鱼后PC2抗菌肽基因的表达影响

黄颡鱼腹腔注射铜绿假单胞菌PA-5后，PC2抗菌肽基因在肝脏组织的表达量相对于0 h均出现不同程度上调，其中24,36与0 h差异显著(P<0.05)，感染后24 h表达量最高(图4-1)。PC2抗菌肽基因在肾脏组织的表达量相对于0 h均出现不同程度上调，其中24,36与0 h差异显著(P<0.05)，感染后24 h表达量最高(图4-2)。PC2抗菌肽基因在表皮组织的表达量相对于0 h均出现不同程度上调，其中36,48与0 h差异显著(P<0.05)，感染后36 h表达量最高(图4-3)。

图4 铜绿假单胞菌PA-5侵染健康黄颡鱼后PC2抗菌肽基因表达的影响

2.6 铜绿假单胞菌PA-5侵染健康黄颡鱼后PC3抗菌肽基因的表达影响

黄颡鱼腹腔注射铜绿假单胞菌PA-5后，PC3抗菌肽基因在肝脏组织的表达量相对于0 h均出现不同程度上调，其中24,36 与0 h差异显著(P<0.05)，感染后24 h表达量最高(图5-1)。PC3抗菌肽基因在肾脏组织的表达量相对于0 h均出现不同程度上调，其中24,36与0 h差异显著(P<0.05)，感染后24 h表达量最高(图5-2)。PC3抗菌肽基因在表皮组织的表达量相对于0 h均出现不同程度上调，其中36,48与0 h差异显著(P<0.05)，感染后36 h表达量最高(图5-3)。

图5 铜绿假单胞菌PA-5侵染健康黄颡鱼后PC3抗菌肽基因的表达

3 讨 论

铜绿假单胞菌属于变形菌门，γ-变形菌纲，假单胞菌目，假单胞菌科，假单胞菌属。其存在的水环境条件比较恶劣，从而引发鱼类及其他水产动物产生感染，并产生疾病。该致病菌感染黄颡鱼后，会引发集体感染，引发群体性事件，并产生较强的并发症。铜绿假单胞菌作为一种条件致病菌，发病机制较为复杂，但是水环境条件的恶化有着至关重要的关系。众多科学家研究表明，其可以感染鲤鱼、黄颡鱼、河鲈、鲫鱼等多种经济鱼类。铜绿假单胞菌的常规鉴定方法中，常规的生长特性和生理生化特性较为精准，是目前研究中常用的方法。同时采用16SrDNA和其他特性基因为目的基因的多重PCR方法对铜绿假单胞菌进行鉴定也同样存在良好的应用价值[5]。本研究从湖北省汉川市同旺养殖场的染病黄颡鱼肝脏中取样，使用划线分离纯化技术获得致病菌菌株，在营养琼脂平板上培养后，生长速度快，形态较为均一，从而命名为PA-5。使用VITEK-32全自动微生物分析仪进行操作后，获得其生长特性和生理生化特征，其具有铜绿假单胞菌基本特征。也对养殖场的染病黄颡鱼进行了多重PCR技术测定，结果表明，铜绿假单胞菌PA-5同时携带有16SrRNA和gyrB基因。表明菌株PA-5具有铜绿假单胞菌序列特征以及溶血性病原的特征。人工注射菌株PA-5到健康黄颡鱼鱼体中，其能侵染寄主的肾脏、肝脏和血液等，引发其广泛性出血、全身性肿胀、颗粒样病变、大量组织坏死和红细胞裂解。症状与铜绿假单胞菌自然病例相似，分离得到的菌株与接种菌株相同，菌落形态也相似。

水产动物受到病原菌感染后，机体会迅速产生免疫应答，有助于生成体内免疫因子以消除病原菌。鱼类生物体中产生了抗菌肽就是重要的免疫因子，可以分布在不同的组织器官。抗菌肽可以发挥多种生物学功能，但是其主要的功能是对病原菌产生拮抗作用，可以抑制细菌，寄生虫和病毒等[10]。鱼类动物的生长环境较为复杂，病原菌种类较多，抗菌肽的数量也较多，现在已经明确的有150余种。鱼源抗菌肽除了具有抗菌肽的共有特性，包括广谱抗菌、免疫调控，还有种属特异性，从而保证不同鱼类应对复杂水体环境和不同病原体[11]。因此，鱼类生物的抗菌肽在疾病的预防和治疗等方面具有优良的应用前景，可以用于制备疫苗和抗生素。众多前人科学研究揭示，鱼类动物的肝脏组织和肾脏组织可以产生抗菌肽之外，皮肤腺体也能够合成多种抗菌肽，促进鱼类生物有效地防御病原体[12]。本研究将分离得到的铜绿假单胞菌PA-5腹腔注射侵染健康黄颡鱼，分别在侵染后0～96 h随机选取黄颡鱼解剖并进行取样检测。结果揭示，黄颡鱼肝脏组织中抗菌肽基因PC1/PC2/PC3的相对表达量受侵染24和36 h显著高于对照组；黄颡鱼肾脏组织中抗菌肽基因PC1/PC2/PC3的相对表达量受侵染24和36 h显著高于对照组；而在黄颡鱼皮肤组织中，抗菌肽基因PC1/PC2/PC3的相对表达量受侵染36和48 h时显著高于对照组。从而说明黄颡鱼抗菌肽基因PC1/PC2/PC3在肝脏和肾脏中响应病原菌的感染比在表皮组织中更加迅速，这或许就是肠道病原菌的通用特点。所以抗菌肽在内脏组织的特异表达对启动鱼体天然免疫应答抵抗病原菌感染具有更加积极作用。健康黄颡鱼注射铜绿假单胞菌PA-5后，能够促进其全身性抗菌肽基因表达量上调，证实黄颡鱼免疫系统可以快速应答于病原体，其抗菌肽在黄颡鱼免疫系统中发挥重要的作用。从而为揭示抗菌肽在病原体感染鱼体生物的响应机制提供了理论依据和试验数据基础。

4 结 论

湖北省汉川市同旺养殖场患病黄颡鱼的病原菌种类得到分离和鉴定并分析其影响寄主抗菌肽基因表达的特点。以患病黄颡鱼肝脏作为样本，使用划线培养的技术，分离得到病原菌PA-5。对病原菌进行革兰氏染色和显微镜观察，其形态为长棒状，革兰氏染色为阴性。再进行VITEK-32全自动微生物分析鉴定仪操作，该病原菌对D-葡糖酸、丙二酸和葡萄糖等反应灵敏，对黏菌素、七叶苷和阿拉伯糖等反应迟钝。采用多重PCR技术对该菌16SrRNA和gyrB基因序列分析后发现，该菌与铜绿假单胞菌的特征序列相似，亲缘关系较为接近，综合后鉴定该病原菌为铜绿假单胞菌。同时以该病原菌为样本，分析其感染黄颡鱼后，对寄主抗菌肽基因PC1/PC2/PC3的表达影响。在黄颡鱼的腹腔中注射3.0×106cfu/mL铜绿假单胞菌PA-5，侵染完成后0～96 h分别解剖获取黄颡鱼的肝脏，肾脏以及表皮组织。然后利用Trizol试剂盒操作获取黄颡鱼总RNA，反转录合成cDNA后应用实时荧光定量PCR技术分析黄颡鱼抗菌肽基因PC1/PC2/PC3基因表达变化特点。铜绿假单胞菌PA-5侵染黄颡鱼后，寄主肝脏组织中的抗菌肽基因PC1/PC2/PC3相对表达量24，36 h较高，与对照组比较显著(P<0.05)；寄主肾脏组织中的抗菌肽基因PC1/PC2/PC3相对表达量24，36 h较高，与对照组比较显著(P<0.05)；寄主表皮组织中的抗菌肽基因PC1/PC2/PC3相对表达量36，48 h较高，与对照组比较显著(P<0.05)。寄主肝脏组织，肾脏组织，表皮组织抗菌肽基因的表达均快速增加，但是肝脏组织和肾脏组织反应时间早于表皮组织。因此，铜绿假单胞菌PA-5是湖北省汉川市同旺养殖场黄颡鱼的主要病原体，其感染黄颡鱼后，寄主抗菌肽基因PC1/PC2/PC3会积极响应，这些基因的大量表达有助于鱼体天然免疫应答，有助于抵抗病原微生物的感染。