荔波瑶山鸡血管活性肠肽及其受体基因变异与繁殖性状的关联性

伍革民，朱丽莉，韩 雪，唐继高

(贵州省农业科学院 畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

【研究意义】荔波瑶山鸡原产于贵州省荔波县，具有耐粗饲、抗逆性强、适应性强、饲料报酬高、肉质鲜美细嫩等特点，是贵州地方鸡生长发育较快的鸡种之一。荔波瑶山鸡年产蛋量90枚左右，就巢性强，散养就巢性达95%。经笔者所在项目组经过多个世代的常规选育，荔波瑶山鸡产蛋量提高到110枚左右，但后期常规选育进展缓慢，而探索关键基因标记辅助选择，可能成为荔波瑶山鸡产蛋性能进一步快速提高的一种有效途径。【前人研究进展】血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)属于胃泌素/分泌素/胰高血糖素家族的分泌型多肽，由28个氨基酸组成,并与有不同结构特点的G蛋白偶联受体VIP受体1(VIPR-1)及VIP受体2(VIPR-2)结合。VIP/VIPR系统的激活可介导血管扩张、血浆外渗、肥大细胞脱颗粒、免疫调节等多方面的生理过程[1]。在家禽繁殖周期调节中，VIP作用于垂体，通过其受体介导，与垂体腺苷酸环化酶激活多肽参与下丘脑-垂体-性腺轴的相关功能，刺激和调控催乳素的分泌和释放，调控家禽就巢行为和产蛋性能[2-3]。有研究表明，VIP、VIPR-1和VIPR-2基因多态性丰富，个别位点与鸡就巢性、蛋形指数呈显著或极显著相关[3-7]。【本研究切入点】探明VIP及VIP受体基因与荔波瑶山鸡产蛋性能、就巢性的关联情况，从数据库及文献中选择基因变异位点进行PCR测序检测并开展位点关联分析。【拟解决的关键问题】找出可作为荔波瑶山鸡繁殖性状选育的重要标记。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用荔波瑶山鸡为120日龄母鸡，60只，由贵阳市乌当区百宜乡洛坝村种鸡场提供，均采用常规饲养管理方式，个体笼养，群体一致性较好，性能稳定。翅下静脉采血1.0～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20 ℃保存。

1.2 性状测定

120 日龄母鸡转入产蛋舍单个笼养至300日龄，测定开产日龄、产蛋性能、就巢性等繁殖性状，测定方法按照NY/T 823-2004[8]进行。

1.3 基因组DNA提取及引物设计

采用TIANamp Blood DNA Kit试剂盒提取血样DNA。VIP根据GenBank该基因7个外显子和部分内含子设计引物，VIPR-1和VIPR-2根据GenBank和文献中的变异位点，在GenBank中在线设计引物，引物由天根生化科技有限公司合成。PCR检测变异位点在荔波瑶山鸡中的基因型遗传变异情况。检测的位点、引物序列、扩增长度以及检测方法见表1。

1.4 PCR扩增及测序

PCR反应体系：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR MasterMix 试剂10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反应参数：95 ℃预变性6 min；95 ℃变性30 s，特定温度(表1)退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物委托诺赛基因组研究中心有限公司测序，即利用30只个体组成的混合DNA池作DNA模板，进行PCR扩增并测序，分析序列多态性；针对存在多态位点的引物，逐一对60个样本进行单独测序。

1.5 数据统计分析

使用DNAstar对测序结果进行校正，进入基因库网站采用BLAST分析序列SNPs，采用DNAMAN软件分析SNPs变异导致蛋白质编码变异的情况。以Excel统计基因分型，利用SPSS 18.0采用单因子方差分析法分析基因型与繁殖性状的相关性。

2 结果与分析

2.1 多态位点和遗传多样性

从表2看出，VIP基因P4引物检测出1个多态位点，VIPR-1基因P6、P7、P8引物共检测出16个多态位点，VIPR-2基因P10、P11引物检共测出3个多态位点。VIPR-1基因16个多态位点包括1个编码区突变、1个10 bp(AAAATGTCTT)插入/缺失突变和14个内含子替换突变；编码突变位于VIPR-1基因68 817位置(mRNA 327位置，第4外显子区域，T→C)，导致该蛋白质第109个氨基酸缬氨酸发生同义突变(V：GUU→GUC)；10 bp(AAAATGTCTT)插入/缺失突变位于基因39 114位置，其余14个内含子替换突变分布于第2和10内含子中。VIPR-2基因3个多态位点，包括1个编码区突变和2个内含子替换突变；编码区突变位于基因位置49 246(mRNA位置1050，第11外显子，T→C)，导致第350个氨基酸脯氨酸发生同义突变(P：CCU→CCC)；内含子突变分别位于第2内含子基因位置3784(G→A)和基因位置3739(A→G)。另外，GenBank数据库检索发现，荔波瑶山鸡VIPR-2基因序列相对于数据库序列具有5个独特的突变，分别为基因位置49 246(mRNA位置1050，第11外显子，T→C)，导致该蛋白第350个氨基酸-脯氨酸发生同义突变(P：CCU→CCC)，基因位置49 248(mRNA位置1052，第11外显子,A→G)以及基因位置49 249(mRNA位置1053，第11外显子，C→G),2个变异位置位于同一密码子内，导致该蛋白质第351个氨基酸发生错义突变(天冬氨酸D→甘氨酸G)(GAC→GGG)，基因位置49 388(mRNA位置1103，第12外显子，G→A)，导致第371个氨基酸-亮氨酸发生同义突变(L：UUG→UUA)，以及基因位置3664和3665之间插入17 bp(AGAATAAAATAAGTAAA)的序列变异。

表2 荔波瑶山鸡VIP及其受体基因的多态位点

2.2 多态位点与繁殖性状的相关性

从表3可知,①VIP基因检测出1个多态位点5010，但该位点各基因型间300日龄产蛋量及各就巢性状差异均不显著。②VIPR-1基因检测出的16个多态位点中，与300日龄产蛋量或就巢性状显著关联的多态位点有6个。其中，位点39 109各基因型间差异显著的性状有开产日龄、首次就巢至重新开产间隔及300日龄就巢次数，差异极显著的性状有300日龄产蛋量和首次就巢日龄；位点39 114插入纯合基因型300日龄产蛋量比插入杂合基因型、缺失纯合基因型显著降低，其余性状间差异不显著；位点39 227各基因型间300日龄产蛋量差异极显著，基因型GG首次就巢持续时间显著高于其他两种基因型，基因型TT300日龄就巢次数显著低于其他两种基因型；位点68 817各基因型间，差异显著的性状有开产日龄、首次就巢至重新开产间隔及首次就巢持续时间，差异极显著的性状有300日龄产蛋量、首次就巢日龄和300日龄就巢次数；位点69 061各基因型间差异显著的性状有300日龄产蛋量和首次就巢日龄，差异极显著的性状是300日龄就巢次数；位点97 123各基因型间差异显著的性状有首次就巢持续时间，差异极显著的性状有300日龄产蛋量、首次就巢日龄、首次就巢至重新开产间隔和300日龄就巢次数。③VIPR-2基因检测出的3个多态位点3739、3184、49 246各基因型间300日龄产蛋量呈显著或极显著相关，位点3739和位点49 246各基因型间首次就巢持续时间、首次就巢至重新开产间隔呈显著或极显著相关。

表3 VIP及其受体基因多态位点与繁殖性状的相关性

3 讨 论

鸡VIP基因定位于3号染色体上，包括7个外显子和6个内含子。VIP的mRNA目前发现有2种转录本，转录本1转录了所有1个外显子，编码200个氨基酸，而转录本2比转录本1少外显子4的拼接，编码165个氨基酸[9]。周敏等[10]研究发现，江西宁都三黄鸡VIP基因4个SNP突变位点与不同日龄的鸡冠高度存在极显著或一定程度的相关；黄孙平等[11]研究表明，四明香鸡B系VIP基因A-3458G位点各基因型间65周体重差异达显著水平(P<0.05)，与产蛋量相关不显著。杜颖军[12]发现，5′-UTR的3个突变(A-1784G、-2648-2650缺失和C-3143T)和1个外显子突变(G+780T)4个位点均与鸡的繁殖性状相关。ZHOU等[13]研究发现，宁都三黄鸡-2648-2650缺失显著影响90～300日齡产蛋量、C+338T对就巢持续时间影响显著。杨恒[5]研究发现，欣华鸡E系VIP基因5′-UTR存在1个显著影响蛋形指数的位点A-3458G。本研究重点筛查荔波瑶山鸡VIP基因7个外显子区域的突变，引物围绕7个外显子设计，结果表明，在荔波瑶山鸡检测到的7个外显子区域均未发现多态位点，仅在第6内含子(基因5010位置)发现1个多态位点C→A，但各基因型间产蛋量及就巢性状均差异不显著，这与以上研究结果不太一致，可能与鸡品种有关。另外，试验中没有检测到的其他内含子区域是否存在影响荔波瑶山鸡繁殖性状的多态位点还有待进一步研究。

VIPR-1是一种与G蛋白偶联的7次跨膜糖蛋白，属于促胰泌素/VIP受体亚族[14]。鸡VIPR-1基因定位于 2号染色体短臂(2p3.2)，全长104 263 bp，包括13个外显子，12个内含子[15]。ZHOU等[16]以宁都三黄鸡第4代群体进行标记与就巢性的关联分析发现，位点C+598T与C+53327T对宁都三黄鸡的就巢行为有显著影响(P<0.05)。周敏等[6]通过对VIPR-1基因5′(-496～-1 bp)调控区多态性与清远麻鸡就巢性状的相关性研究结果表明，VIPR-1基因G-359T、G-266T、A-134-、A-94G、C-72G突变与18～43周龄就巢持续天数显著相关，且A-94G突变还与鸡就巢率显著相关，12个多态位点构成的单倍型与就巢持续天数极显著相关。周敏等[17]研究发现，位于内含子6的位点C+42913T与宁都三黄鸡300日龄总产蛋数和300日龄的总正常蛋数显著相关(P<0.05)，与清远麻鸡40周龄、43周龄以及54周龄的总产蛋数和总正常蛋数显著相关(P<0.05)。内含子8的位点C+53327T与宁都三黄鸡开产日龄极显著相关(P<0.01)、与300日龄就巢持续天数呈显著相关(P<0.05)。以鸡VIPR-1基因作为鸡冠高度和体重的候选基因，周敏等[18]选取了12个多态位点对586只宁都三黄鸡进行基因型检测并分析其与这2个性状的相关性研究表明，位于内含子2的位点C+598T与84日龄体重显著相关(P<0.05)；位于内含子8的位点C+53327T与77日龄体重和 91日龄体重呈极显著相关(P<0.01)，但此12个位点与不同日龄的鸡冠高度不相关。赵振华[19]研究表明，VIPR-1基因C73352T突变位点，TT基因型个体冠高、冠面积和肉垂面积显著大于CC基因型个体(P<0.05)，T68818C位点各基因型个体间冠高、冠面积和肉垂面积差异显著(P<0.05)。

VIPR-1基因DNA序列全长104 263 bp，该基因外显子短，内含子序列很长，对全基因测序耗费高，从文献及数据库中检索SNP及缺失/插入突变，共检索到该基因1210个变异位点，说明该基因序列多态性丰富，但大部分变异位点位于内含子区域。本研究针对荔波瑶山鸡该基因的调控区、外显子及插入/缺失突变检测出16个多态位点，其中6个位点与300日龄产蛋量或就巢性状显著关联，6个位点包括位于内含子2区域的39 109、39 114、39 227位点，外显子4区域的68 817位点以及内含子4区域的69 061、97 123位点。外显子4的68 817位点T→C变异，导致该蛋白质第109个氨基酸-缬氨酸发生同义突变(V：GUU→GUC)；赵振华[19]研究表明，该同义突变位点与鸡冠高、冠面积和肉垂面积显著相关；本研究发现，该同义突变与荔波瑶山鸡的300日龄产蛋量、开产日龄、就巢性状呈显著或极显著相关，说明该基因位点可以作为鸡的繁殖性状选育标记，用于鸡的辅助选育。设计引物P4是为检测出NCBI数据库查询到的39 114位点的10 bp(AAAATGTCTT)插入/缺失突变，在荔波瑶山鸡中检测到了该变异位点，同时发现该位点插入纯合基因型300日龄产蛋量显著降低；另外，利用该引物还检测到了位于该插入/缺失位点两侧的新变异位点39 109和39 227与产蛋量或就巢性状显著相关。上述位点可用于荔波瑶山鸡繁殖性状的辅助选育。

VIPR-2基因位于鸡2号染色体上，DNA序列全长50 748 bp，包括13个外显子和12个内含子，对该基因与鸡繁殖性状的关联研究相对较少。赵振华[19]研究表明，VIPR-2基因A36127G位点GG基因型个体冠高、冠面积和肉垂面积显著大于AA和AG基因型个体(P<0.05)。从数据库及文献中共检索到该基因变异位点655个，说明该基因变异多态性丰富。本研究表明，荔波瑶山鸡VIPR-2基因检测到3个多态位点，包括1个编码区突变和2个内含子替换突变。研究还发现，荔波瑶山鸡品种相对于数据库序列独特的变异位点5个，包括4个编码区变异和1个17 bp(AGAATAAAATAAGTAAA)插入突变。4个编码区变异分别导致该基因编码蛋白质第350个氨基酸发生同义突变(脯氨酸P：CCU→CCC)、第351个氨基酸发生错义突变(天冬氨酸D→甘氨酸G，GAC→GGG)以及第371个氨基酸发生同义突变(亮氨酸 L：UUG→UUA)，这些变异可能是荔波瑶山鸡的品种特征，其功能情况有待进一步分析。关联分析表明，检测到的荔波瑶山鸡VIPR-2基因的3个多态位点3739、3184、49 246各基因型间300日龄产蛋量或就巢性状呈显著或极显著相关，这些位点可作为荔波瑶山鸡繁殖性状选育的标记开展进一步研究分析。

4 结 论

荔波瑶山鸡VIP及其受体VIPR-1和VIPR-2共检测20个多态位点。VIP基因检测的范围广，包括所有外显子区域及部分内含子区域，但变异少，仅检测到1个多态位点，且该多态位点与产蛋和就巢性状均无显著关联。VIP受体基因VIPR-1和VIPR-2仅对其部分区域进行选择性检测，但检测到的位点多态性丰富，VIPR-1检测到16个多态位点，VIPR-2检测到3个多态位点，另外VIPR-2检测到5处品种独特突变。VIPR-1的6个多态位点以及VIPR-2的3个多态位点与产蛋量、就巢性状呈显著或极显著关联。说明，VIP受体基因VIPR-1和VIPR-2可作为荔波瑶山鸡繁殖性状选育的候选基因，该结果为利用分子标记辅助选择提高荔波瑶山鸡的繁殖性能奠定一定的基础。