构树皮提取物软膏的制备及含量测定

戴 晨，朱治文，陈 建，开伟华

(1.铜陵职业技术学院；2.安徽安科恒益药业有限公司，安徽 铜陵 244000)

构树别名彀、楮树、沙低树、谷浆树等，为桑科(Moreceae)构树属，构树[Broussonetiapapyrifera(L.) vent]的茎皮，性味甘平，具有祛风止痒、利水、祛风散热，治风疹、风疹、目赤肿痛、小便不利之功效[1]。黄酮类成分是构树皮的主要成分[1-2]。课题前期，课题组选用聚酰胺树脂分离纯化总黄酮化合物，并筛选构树皮总黄酮的最优工艺，平皿药基法研究结果表明，构树皮提取液对红色毛癣菌和絮状表皮癣菌的抑菌效果显著[3]。软膏剂作为透皮给药的一种剂型，主要起保护和润滑皮肤、粘膜及局部治疗的作用，软膏中的药物可通过透皮吸收达到治疗目的。本实验在提取工艺不变的基础上，将构树皮提取液作为水相进一步制成软膏，并考察软膏的外观性状、粒度、稳定性、总黄酮含量，为构树皮软膏的临床应用提供参考。

1 仪器与试药

电子分析天平(Shimadzu，AP225WD，0.1 mg)，旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)，紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，显微镜(BX53+DP27，日本OLYMPUS)

构树皮采集于安徽铜陵(铜陵市食品药品检验中心鉴定)，槲皮素对照品(100081-201610)(98%，Sigma Aldrich)，聚酰胺树脂(60～100目，西亚试剂)，液状石蜡、凡士林、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、单硬脂酸甘油酯、甘油均购自国药集团化学试剂有限公司，水为纯化水。

2 实验方法与结果

2.1 提取液制备构树皮粉末过3号筛，以70%乙醇超声20 min，滤过，合并滤液，减压浓缩配成60 mg/mL的构树皮粗提物溶液，以1 BV/h流速上样，充分吸附4 h，用蒸馏水洗至流出液为无色后，用60%乙醇以流速1 BV/h进行洗脱，重复洗脱3个周期，减压回收至无醇味，浓缩至原药材粉末浓度约2 g/mL，4 ℃冷藏备用[4]。

2.2 构树皮提取物乳膏制备本试验“2.1”项下提取液代替蒸馏水，同时也为软膏主药。根据文献调研和预试验结果，试验中固定凡士林-硬脂酸-液体石蜡质量比例(1.2∶1∶1)共30 g，十二烷基硫酸钠10 g、单硬脂酸甘油酯6 g、甘油15 g、羟苯乙酯0.1 g、提取液适量，处方总量100 g。油相：凡士林-硬脂酸-液体石蜡和单硬脂酸甘油酯；水相：提取液、甘油、十二烷基硫酸钠、羟苯乙酯，分别置于蒸发皿中，水浴加热至80 ℃，在等温条件下将水相缓缓倒入油相中，以转速200～300 r/min不断搅拌20 min，使之充分乳化至冷凝，即得构树皮提取物软膏。

2.3 软膏组方优化

2.3.1 综合考察指标 以软膏外观均匀细腻性、涂抹延展性、离心稳定性、耐寒耐热性作为成型性考察指标[5]，按照表1进行评分，具体如下：(1)外观：取软膏适量，目检外观是否色泽均匀、细腻，静置是否发生自然分层，记录结果并评分。(2)涂抹延展性：取软膏适量涂抹于手背部观察涂布是否有颗粒，记录结果并评分。(3)离心稳定性：分别取各处方下的软膏样品1 g，置于离心管中，于4000 r/min的条件下离心30 min，观察其外观、分层及涂展性变化，记录结果并评分。(4)耐寒性实验：分别取各处方下的软膏样品1 g，置于离心管中，于-15 ℃条件下静置24 h，观察上述试验样品是否发生分层、变色等，记录结果并评分。(5)耐热性实验：分别取各处方下的软膏样品1 g，置于离心管中，于55 ℃条件下静置24 h，观察上述试验样品是否发生分层、变色等，记录结果并评分。对以上5项试验的得分进行加和，作为最终评分结果。

表1 处方筛选各项指标考察评分表

2.3.2 响应面设计 在预试验基础上，根据响应面设计法的原理[6-8]，选择对乳膏质量影响较为显著的油相(凡士林-硬脂酸-液体石蜡)质量分数(X1)、乳化剂比(单硬脂酸甘油酯：十二烷基硫酸钠)(X2)、甘油质量分数(X3)作为考察因素,采用Design-Expert试验设计软件，将以上3个因素作为优化的对象，考察其对综合指标(Y)的影响。因素水平见表2，响应试验方案及结果见表3。

表2 因素水平表

表3 中心组合试验设计与结果

2.3.3 模型方程的建立及显著性检验 利用Design Expert 8.0.6软件，采用响应面分析法中的Box-Behnken Design建立数学模型，以综合考察评分进行优化试验设计，对表3所得数据进行二项式方程拟合，结果如下：

二项式拟合模型：

Y=96-1.87X1-0.75X2-0.88X3-X1X2-0.25X1X3-5.5X2X3-9.13X12-5.38X22-5.12X32

表4 响应模拟结果方差分析

2.3.4 效应面优化与预测 结合二项式拟合方程，利用Design-Expert 8.0.6软件绘制因变量3D响应面图及等高线，考察拟合的响应面曲线形状，并通过响应面等高线图和曲线图对影响软膏剂成型的条件中A、B、C三种因素交互作用效应进行评价和分析，从而确立X1、X2和X3，见图1～3。由图可知，软膏成型随X1、X3的增加先增大后减小，但随X2的增加明显具有增大效应，但影响不显著；X2X3等高线的交互作用对软膏成型影响最为显著，而X1X2、X1X3等高线的交互作用对软膏成型影响不显著。本实验对回归方程进行预测，得到最大预测值96，X1=34，X2=7，X3=2。即凡士林-硬脂酸-液体石蜡用量为34%，单硬脂酸甘油酯：十二烷基硫酸钠比为7，甘油用量2%。

图1 X1X2对Y的效应面图

图2 X2X3对Y的效应面图

图3 X1X3对Y的效应面图

2.3.5 工艺验证 根据优选出的构树皮提取物软膏各称取1 g，制备3份，将优化处方所对应X1、X2和X3代入回归方程，求得Y预测值，按偏差%=(预测值-实测值)/预测值×100%，结果见表5。试验表明，实测值与预测值相当，优化的参数准确可靠，软膏组方科学合理可行。

表5 Y实测值与偏差

2.4 构树皮提取物软膏质量控制

2.4.1 性状 本品为淡黄色的细腻膏状半固体，气微香、味微苦。

2.4.2 粒度 取供试品适量，置于载玻片上涂成薄层，薄层面积相当于盖玻片面积，共涂3片，在显微镜下观察，按照粒度和粒度分布测定法(通则0982第一法)进行测定[9]，见图4。粒子最大直径为12.48 μm，视野中均未发现大于180 μm的粒子，符合规定。

图4 构树皮提取软膏粒径显微图(×40)

2.4.3 稳定性离心试验 取乳膏10 g装入带刻度的离心管中，以2500 r/min转速离心30 min，乳膏无油水分层现象。

2.4.4 pH值的测定 取本品5 g，加水25 mL稀释搅拌均匀后测定，得乳膏pH 6.8，RSD=2.3%(n=3)。

2.5 树皮提取物软膏总黄酮含量测定

2.5.1 对照品溶液配制 按照课题前期研究方法，取槲皮素对照品适量，加甲醇溶解定容，摇匀，制成0.1 mg/mL槲皮素对照品溶液备用[10]。

2.5.2 供试品溶液配制 取构树皮提取物软膏0.5 g，精密称定，加甲醇溶解摇匀，配成10 mg/mL构树皮提取物液[11]。

2.5.3 标准曲线绘制 精密量取槲皮素液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置10 mL具塞试管中，分别加1%三氯化铝-甲醇液1 mL，加甲醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min，以不加槲皮素标准液为空白，在270 nm波长下测定吸光度[12]。得出标准曲线A=0.027 C+0.0031，相关系数r=0.9996，说明槲皮素含量在0～50 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。

2.5.4 精密度试验 精密量取槲皮素对照品贮备液(0.1 mg/mL)3.0 mL，按2.5.3项下方法测定，以不加槲皮素标准液为空白，在270 nm波长下测定吸光度，连续测定6次，结果吸光度相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为1.74，表明仪器精密度良好。

2.5.5 重复性试验 取供试品溶液1 mL，制备6份样品，按2.5.3项下方法测定吸光度，RSD 1.65%。

2.5.6 稳定性试验 取供试品溶液1 mL，制备6份样品，分别于0、15、30、40、50、60 min按2.5.3项下方法测定，结果吸光度的RSD为1.73%，表明供液在1 h内基本稳定。

2.5.7 加样回收率试验 精密称取构树皮提取物软膏0.25 g，平行样品6份，分别精密加入槲皮素对照品适量，按照2.5.2和2.5.3项下方法处理，测定吸光度，计算平均回收率99.23%，RSD 1.82%。

2.5.8 总黄酮含量测定 取0.5 g构树皮提取物软膏3份，精密称定，加甲醇溶解摇匀，配成10 mg/mL构树皮提取物液，精密量取1.0 mL 1%三氯化铝甲醇溶液1 mL，摇匀，放置显色15 min后，由回归方程求出3份软膏中构树皮提取物总黄酮含量，见表6。

表6 总黄酮含量测定

3 讨论

3.1 制剂处方软膏中乳剂型基质比油脂性基质易用于水除去，乳化剂可促进药物与表皮接触，本方选用乳剂型基质软膏。乳剂型基质分为O/W型和W/O型，O/W型乳剂型基质油腻性低，能与水大量混合，药物释放和透皮吸收比较快[13]。因此本试验选用O/W型乳膏，但O/W型基质含量水量多，在贮存过程中易干涸和霉变，方中加入保湿剂甘油和防腐剂羟苯乙酯。

3.2 试验设计方法响应面优化法适用于解决非线性数据处理的相关问题，它考虑了试验随机误差，在试验条件寻优过程中，将复杂的未知函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，可以连续的对试验各个水平进行分析，相比正交实验只能对一个个孤立的实验点进行分析，响应面优化法占有显著优势。因此本试验选用响应面分析法优化构树皮提取物软膏的基质配比，在试验设计范围内，直接采用二次多项式非线性模型拟合与预测，效应面图较好地描述影响因素与综合指标的关系。

3.3 构树皮前景展望构树皮具有利湿祛痰、清热凉血等功效，前期课题组发现构树皮对红色毛癣菌和絮状表皮癣菌有强大抑制作用[4]，课题组提取构树皮总黄酮活性成分，并将其进一步制成软膏剂，该制剂具有制备工艺简单可行，适合工业化生产等优点，该制剂的成果研制不仅可满足局部浅部真菌感染患者的需求，而且具有广阔的市场前景，为开发抗真菌新药奠定基础。