AIF核转位在海藻糖抑制OGD诱导SH-SY5Y细胞死亡过程中的作用及机制

王本玄，尹昌浩

(1.牡丹江医学院；2.黑龙江省缺血性卒中防治重点实验室;3.牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011)

缺血性脑卒中是一种急性脑功能障碍，是全球发病率和死亡率高的主要原因[1]。目前，缺血性脑卒中的干预和临床治疗虽然得到了改善，但其不良预后并没有得到有效逆转[2-3]。AIF是能够诱导非caspase依赖性细胞死亡的促凋亡蛋白。近年来发现在凋亡信号刺激下，核AIF通过诱导染色质溶解和DNA断裂最终导致细胞死亡。海藻糖是一种安全、稳定的双糖[4]，它可通过抑制缺氧引起的氧化应激来挽救细胞死亡[5]。SH-SY5Y细胞是人类神经母细胞瘤细胞，在形态、神经化学和电生理方面具有与神经元相似的特性。因此，本课题采用SH-SY5Y细胞氧糖剥夺模型进行研究AIF在氧糖剥夺诱导的细胞死亡中的调控作用及海藻糖的干预机制，为缺血性脑血管病的治疗提供潜在的治疗药物。

1 材料与方法

1.1 试剂人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所(中国)。海藻糖、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)(sigma，美国)，无糖培养基(Gibco，美国)，ROS检测试剂盒(碧云天，中国)，MTT试剂盒(碧云天，中国)，细胞缺氧培养装置(Billups-rothenberg公司，美国)，抗AIF抗体(美国的CST公司)，抗β-actin抗体(美国的CST公司)。

1.2 细胞培养和方法使用青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μg/mL)和含有10%胎牛血清的DMEM在细胞培养瓶中培养细胞，并将其置于37 °C和5%CO2的恒温培养箱中，每周更换两次培养基。

1.3 实验分组及处理将对数期生长的细胞接种到96孔板中(5～6)×103/孔，次日待细胞贴壁后将细胞分为正常组：不需进行预处理；海藻糖组：海藻糖(0.5 mmol/L、5 mmol/L)处理24 h；NAC组：NAC(5 mmol/L)处理24 h；OGD组：细胞贴壁后更换无糖无血清培养基并缺氧24 h；OGD+海藻糖组：细胞贴壁后更换无糖无血清培养基，海藻糖预处理1 h后再缺氧24 h；OGD+NAC组：细胞贴壁后更换无糖无血清培养基，NAC预处理1 h后再缺氧24 h；按照试剂盒说明操作敲减AIF基因，将SH-SY5Y细胞分为空转组、scrambled组(与AIF基因有相同序列，但无明显同源性)、AIFsiRNA组、OGD空转组、OGD scrambled组(与AIF基因有相同序列，但无明显同源性)、OGD AIFsiRNA组。

1.4 MTT法检测细胞生存率取上述制备的SH-SY5Y细胞，每组设置6个复孔，按照实验要求到作用时间后，弃上清，每孔加入20 μL的MTT溶液，继续培养4 h，弃去培养基加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，摇匀后于酶标仪下检测490 nm处吸光度值，细胞生存率%=样品组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.5 荧光显微镜检测ROS表达情况按照试剂盒使用说明，将制备好的DCFH-DA荧光探针溶液(1∶1000稀释)加到OGD组的SH-SY5Y细胞中，并在避光条件下于37 ℃的恒温培养箱中孵育20 min，后置于荧光显微镜下观察OGD组ROS表达情况。

1.6 siRNA敲减AIF细胞转染(依据siRNA试剂说明书)按照一定比例配置转染复合物，空转组的配比为opt-MEM 10 μL、lipo3000 0.1 μL、DEPC水1 μL；scrambled组的配比为opt-MEM 10 μL、lipo3000 0.1 μL、NC1 μL；AIF siRNA组的配比为opt-MEM 10 μL、lipo3000 0.1 μL、siRNA 1 μL。上述三组份混合后室温孵育10～15 min。从细胞培养箱取出细胞，用基本培养基(无血清无双抗的DMEM培养基)冲洗2遍，按实验分组加入转染复合物，继续孵育48 h。结束后，PBS缓冲液冲洗2次，OGD作用24 h根据实验要求进行MTT检测以及westernblot蛋白印迹分析。

1.7 氧糖剥夺实验模型将对数期生长的细胞6×103接种到96孔板中，于次日对已贴壁的细胞更换无糖、无血清培养基，然后，放入缺氧培养装置中并充入已混合好的5% CO2和95% N2组成的混合气体，并置于37 ℃的恒温孵箱中24 h。

1.8 western blot检测线粒体、细胞质和细胞核AIF蛋白表达情况收集SH-SY5Y细胞，提取相关蛋白，根据实验操作要求进行western blot检测，进行电泳、转膜、封闭、孵一抗、二抗、显影等操作[6]，进行AIF蛋白表达检测。

1.9 统计学分析使用SPSS 22.0统计软件对每个测试数据进行统计分析，并使用Graphpad Prism 6.0软件进行绘图。计量资料表示为“均数±标准差”，组间比较通过t检验分析；以P<0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 OGD抑制SH-SY5Y细胞的增殖活力且增加细胞内氧化应激水平MTT检测结果显示，随着OGD作用时间的延长，SH-SY5Y细胞生存率降低(表1)。免疫荧光检测结果显示，ROS荧光强度随着OGD作用时间的延长逐渐增强(图1)。ROS试剂盒检测结果显示，OGD组ROS产生增加(表2)。

表1 OGD作用下SH-SY5Y细胞生存率变化

图1 SH-SY5Y细胞ROS荧光强度变化

表2 OGD作用下SH-SY5Y细胞ROS表达变化

2.2 OGD可引起SH-SY5Y细胞发生AIF的核转位western blot电泳图灰度分析结果显示，OGD组细胞中，细胞质、细胞核AIF蛋白均表达上调，线粒体中AIF蛋白表达下调(表3)。

表3 各组细胞质、细胞核、线粒体内AIF蛋白表达情况

2.3 siRNA敲减AIF可提高OGD作用条件下的SH-SY5Y细胞生存率转染siRNA敲减AIF，MTT检测结果显示，敲减AIF可提高OGD条件下的SH-SY5Y细胞生存率(图2)。

图2 siRNA敲减AIF后，SH-SY5Y细胞生存率变化

2.4 western blot蛋白分析siRNA敲减AIF后各组细胞内AIF变化转染siRNA敲减AIF显示，逆转了AIF在OGD AIFsiRNA组和OGD scrambled组中的蛋白表达(表4)。

表4 各组细胞细胞质、细胞核、线粒体的AIF蛋白表达情况

2.5 海藻糖可逆转OGD引起的SH-SY5Y细胞生存率降低及ROS的增加海藻糖、抗氧化剂NAC预处理均可提高OGD作用条件下的细胞生存率(图3A)。海藻糖预处理抑制OGD引起的SH-SY5Y细胞内ROS水平升高(图3B)。

图3 不同药物预处理后细胞生存率及ROS变化

2.6 AIF蛋白在各组细胞中的表达情况western blot蛋白灰度分析显示，海藻糖、NAC预处理逆转了OGD诱导的AIF在细胞质、细胞核、线粒体中的蛋白表达(表5)。

表5 western blot电泳图蛋白灰度分析各组细胞细胞质、细胞核、线粒体内AIF蛋白表达变化

3 讨论

正常细胞中，ROS以可调节的方式产生并作为重要的信号分子参与到细胞分裂、自噬过程和应激反应的调控[7]。有文献报道，ROS及激活的氧化应激反应在脑缺血疾病的发展过程中起重要作用[8]。我们研究发现，OGD导致SH-SY5Y细胞氧化应激水平升高，引起细胞死亡，这与之前的文献报道相一致。因此，降低脑缺血状态下的氧化应激水平可能对脑缺血损伤具有保护作用[9]。本研究用抗氧化剂NAC预处理明显缓解了OGD诱导的SH-SY5Y细胞死亡，因此，抑制细胞氧化应激水平可降低OGD诱导的SH-SY5Y细胞死亡率。脑缺血状态破坏了细胞内环境稳定，导致细胞内ROS积累，ROS一方面可以通过引起核酸的氧化损伤导致DNA链断裂[10]；另一方面，造成线粒体损伤诱导AIF转位入核，最终导致细胞死亡[3]。以上研究结果在SH-SY5Y细胞系中同样得到了验证，我们推测其机制可能是OGD引起SH-SY5Y细胞内ROS积累，此时，ROS会作用于线粒体引起线粒体膜电位降低，导致位于膜间隙的AIF转位入核引起细胞染色质聚集导致细胞死亡。因此，我们认为OGD作用条件下SH-SY5Y细胞死亡的重要原因可能是氧化应激水平升高导致ROS产生过多最终触发AIF核转位。

海藻糖作为一种安全可靠的天然糖类，当细胞受到外界环境压力时，它可通过减轻氧化应激水平来抑制细胞死亡[11]。在OGD的作用条件下，线粒体损伤是神经细胞死亡的重要原因。在本研究中，海藻糖可以抑制OGD诱导的SH-SY5Y细胞死亡，降低ROS的生成，同时还可以阻止AIF由线粒体向细胞核的转位。因此，我们推测其机制可能是海藻糖通过降低SH-SY5Y细胞内ROS的积累来减少其对线粒体的功能损伤，进而抑制AIF核转位引起的细胞死亡。尽管目前抑制脑梗死氧化应激水平的临床试验并不令人满意[12]，但是探索其它抗氧化剂对缺血性脑卒中的可能作用仍是该领域的主要研究方向之一。

总之，我们的研究表明海藻糖通过缓解OGD诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激水平升高来抑制AIF核转位，从而挽救细胞死亡。因此，深入研究AIF在OGD诱导的细胞死亡中的相关机制是非常重要的，可能为临床减轻缺血性脑损伤提供新的研究方向。