槲皮素抗非小细胞肺癌的靶点预测与验证

贺肖梦 郑燕 徐煜彬

槲皮素是一种各类植物中广泛存在的天然黄酮类有机化合物，化学结构如图1。槲皮素具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎和免疫调节等多种药理学活性，在触发与化学预防有关的多种细胞内途径（如凋亡、细胞周期、解毒、抗氧化复制、细胞侵袭、血管生成）中发挥多效作用[1-2]。研究显示，槲皮素可以抑制NSCLC 肿瘤细胞株的增殖[3]，而槲皮素的抗NSCLC具体靶点尚不明确，仍需进一步探讨。本文采用系统的生物信息学研究方法，联用多个数据库分析并验证槲皮素抗NSCLC 的潜在靶点，为后续深入研究奠定基础。

图1 槲皮素的分子结构

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 网络数据库及工具 槲皮素sdf 文件（PubChem CID:52803430）；TCMSP 数据库（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）；Comparative Toxi -cogenomics Database（https://ctdbase.org/）；Swiss TargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）；Therapeutic Target Database（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）；分子对接服务器（https://www.dockingserver.com/web/docking/449200/?）。

1.1.2 细胞、实验药物与试剂

NSCLC 细胞系A549、H1975 购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，RPMI1640 培养基（22400089）购自Gibco 公司，胎牛血清（GNM12250）购自浙江吉诺生物医药技术有限公司。槲皮素（69022033）购于国药集团化学试剂有限公司。CDK1抗体（ab201008）购自Abcam 公司，BCA 蛋白定量试剂盒（WLA004a）、β-actin 抗体（WL01372）、ECL 显影试剂盒（WLA003a）等均购于沈阳万类生物科技有限公司，CCK8 试剂盒（C0038）购自碧云天生物。

1.2 方法

1.2.1 关键药理学和分子特性参数 TCMSP 数据库提供槲皮素体内吸收、分布、代谢及排泄过程（ADME）和分子特性数据，有助于评价药物成药性。

1.2.2 药物和疾病靶点预测 应用CTD 对槲皮素进行化学-蛋白/基因相互作用分析，Swiss Target Prediction 则基于药物2D/3D 结构，各自筛选数据库中可能的药物作用靶点。应用TTD 预测NSCLC 疾病中的关键基因。

1.2.3 分子对接筛选靶点 在分子对接服务器上输入候选靶点蛋白PDB ID，上传槲皮素sdf 文件，模拟分子对接筛选作用靶点。

1.2.4 细胞培养 A549、H1975 细胞以含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基（1%双抗），培养于37℃，5%CO2的恒温细胞培养箱。相关实验均选用对数生长期细胞进行。

1.2.5 Western blot 实验验证槲皮素对NSCLC 细胞CDK1 表达的影响 NSCLC 细胞系A549、H1975 以1×106个/孔接种于6 孔板，37℃，5%CO2条件下，培养24h。观察细胞已贴壁且呈正常生长形态，即可进行梯度浓度给药，分别以槲皮素0、15、30μM 作用48h。提取细胞总蛋白，BCA 法定量。以30μg/孔上样量进行电泳分离，分离后蛋白转至PVDF 膜，含5%脱脂奶粉的TBST 室温封闭2h，TBST 清洗10min，重复3次。CDK1 的抗体液（1∶800）和β-actin 的抗体液（1∶1000）4℃摇床孵育过夜。TBST 洗膜，二抗（浓度分别为1∶1600 和1∶2000）室温摇床孵育2h，TBST 洗膜，ECL 发光显影，凝胶成像仪记录。

1.2.6 CCK8 实验验证槲皮素对NSCLC 细胞增殖的影响 NSCLC 细胞系A549、H1975 以8×103个/孔接种于96 孔板，37℃，5%CO2条件下，培养24h。观察细胞已贴壁且呈正常生长形态，即可进行梯度浓度给药。槲皮素浓度分别为0、15、30μM，另设空白对照，每组3 个复孔，控制培养基体积200μL，继续培养48h。每孔加入CCK8 试剂20μL，细胞培养箱继续孵育2h 后，酶标仪测定各孔OD450 值。

1.3 统计学方法 应用Graphpad Prism 5 软件处理分析数据并作图，组间差异分析采用t-test，双侧检验，95%置信区间。

2 结果

2.1 槲皮素ADME 和分子特性参数 利用TCMSP数据库获得槲皮素体内过程的ADME 和分子特性参数，见表1。

表1 槲皮素药理参数

槲皮素符合TCMSP 平台建议的药物筛选标准（OB≥30%，DL≥0.18），且其口服生物利用率高（OB=46.43%，RBN＜10），HL≥8h 则表明其属于慢速消除组，半衰期较长。Lipinski 5 原则是根据口服药物总结出的经验型规律，是筛选类药分子的基本法则[4]。槲皮素的MW＜500Da，LogP＜5，Hdon=5，Hacc 和RBN 均小于10，表明槲皮素具有较好的药代动力学性质。以上数据提示槲皮素成药性良好，具有一定的应用前景。

2.2 槲皮素抗NSCLC 候选靶点 正确筛选靶向蛋白是药物研发中的关键步骤。本研究利用CTD 数据库发现槲皮素潜在靶点共778 个；从Swiss Target－Prediction 筛选出前100 个潜在药物靶点，两个数据库交集靶点共46 个。TTD 直接检索NSCLC 疾病靶点基因共82 个。综合考虑药物和疾病靶点，共发现潜在目标靶点9 个，见表2。

表2 槲皮素抗NSCLC 候选靶点

2.3 候选靶点分子对接筛选 分子对接结果显示，槲皮素与CDK1、CDK2 和CDK6 的结合能均较低，其中与CDK1 达到-7.85kcal/mol，表明两者对接结果较稳定（见图2）。槲皮素与CDK1 可能通过疏水残基LEU135、ILE10、VAL18 和PHE80 等发生相互作用，进而发挥药理学效应。

图2 槲皮素与CDK1 分子对接示意图

2.4 槲皮素对NSCLC 细胞CDK1 表达和细胞增殖的影响

在A549 细胞中，15μM 和30μM 槲皮素均能减少CDK1 的表达，而在H1975 中仅30μM 槲皮素能有效降低CDK1 水平（见图3）。双细胞系实验结果证实，体外实验中30μM 槲皮素能有效减少NSCLC 细胞中CDK1 的表达，可能进一步影响肿瘤细胞周期，阻滞细胞恶性增殖。

图3 槲皮素降低NSCLC 细胞CDK1 表达水平

进一步实验结果显示，30μM 浓度的槲皮素对两个NSCLC 细胞系的增殖抑制作用均具有统计学意义（见图4）。其中A549 细胞系更为敏感，两个药物浓度均能有效降低细胞增殖速率（P＜0.01）。槲皮素的细胞增殖实验结果与其对CDK1 表达水平改变相一致，提示槲皮素可能通过降低细胞CDK1 表达水平发挥抗NSCLC 作用。

图4 槲皮素抑制NSCLC 细胞增殖

3 讨论

NSCLC 占临床肺癌的近85%，是癌症相关死亡的主要原因之一[6]。NSCLC 起病多隐匿，早期症状不明显，导致疾病常在中晚期才被确诊，使手术切除等早期治疗手段无法及时实施，延误了最佳治疗时机[7]。此外，肺癌靶点治疗药物耐药现象频发，限制了肺癌靶向治疗的临床疗效[8]。寻找新型靶点治疗药物已成为当前肺癌治疗药物的研究重点。有研究指出，槲皮素对肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和结肠癌等多种肿瘤均具有良好的抗癌活性[9]，其抗肿瘤作用具有良好的研究前景。

CDK1 是细胞周期调控中的关键性激酶，主要与细胞周期蛋白B（cyclinB）相互作用来驱动G2-M 转换，也可与其他间期细胞周期蛋白结合（cyclin D1、E、A）调节G1 进展和G1-S 转换[10]。疾病进展中，CDK1 的高表达诱导NSCLC 的细胞周期加速，抑制细胞凋亡，同时影响患者对顺铂的耐药性[11]。研究表明，通过下调CDK1 表达能有效抑制NSCLC 细胞增殖和迁移，同时通过使细胞周期停滞在放射敏感的G2/M 期，有助增强放射治疗疗效[12]。本研究结果显示，一定浓度槲皮素有效降低NSCLC 细胞CDK1 表达的同时能抑制细胞增殖，且两者变化相一致。后续将构建shRNA 进一步研究槲皮素通过调节CDK1水平对细胞增殖、迁移能力的影响及其可能作用的下游通路，同时探讨其对药物耐药和放射敏感性的有益作用。