淫羊藿苷对大鼠骨折模型愈合及转化生长因子β1、血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白-7表达的影响

刘立柱， 李超艺， 林诗炜， 曲 野， 许海军

骨折是最常见的外科手术损伤之一，会影响人们的正常生活0。骨折愈合是器官本身的修复过程，包括炎症、成骨、愈伤组织形成和重塑[2]。研究发现，约有5%～10%的骨折患者在接受常规治疗后会导致愈合延迟或骨不连[3]。已有药物可以增强骨折愈合，但其在骨折愈合的早期阶段效果不佳或者可能有副作用，因此，开发新药以加速骨折愈合过程很重要。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1） 是 一组调节成骨细胞生长和分化的细胞因子[4]。研究发现，TGF-β1在促进骨骼愈合中发挥重要的作用[5]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)是一种二聚体糖蛋白，通过与内皮血管特异受体结合，参与骨折整个过程[6]。研究发现，在骨折愈合组织中，VEGF在检测到血管之前就已经表达，而且VEGF活性的抑制破坏了股骨骨折和皮质骨缺损的骨修复[7]。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）在骨骼发育、产后骨骼生长和骨折修复中起着至关重要的作用[8]。作为BMPs家族的重要成员，骨形态发生蛋白-7（BMP-7）在延迟骨折愈合和非愈合动物模型中均可促进骨折愈合[9]。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分之一，具有促进骨骼合成的作用，这可能有助于其在诱导成骨细胞增殖和分化中的作用，从而促进骨形成[10]。本实验通过探讨淫羊藿苷是否通过调节TGF-β1、VEGF和BMP-7的表达对骨折大鼠的骨愈合能力的影响，为临床治疗骨折提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 动物 45只成年SPF级雄性SD大鼠（200～220 g）购自海南医学院实验动物中心。实验大鼠饲养于标准动物房中，正常饮食饮水，实验动物设计严格经过我院伦理委员会审查。大鼠适应环境两周后进行实验。

1.2 主要试剂 淫羊藿苷（HPLC≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司。大鼠血清白细胞介素（IL）-6试剂盒、大鼠血清中肿瘤坏死因子（TNF）-α和大鼠血清IL-10试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司。血清碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒和骨钙素检测试剂盒购自长春汇力生技术有限公司。RIPA裂解液和BCA试剂盒购自美国promega公司。TGF-β1抗体和VEGF抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。BMP-7抗体、GAPDH抗体和IgG-HRP抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 大鼠骨折模型制备 大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠。待大鼠麻醉后，在其皮肤外侧做一10 mm切口，用钝器解剖后暴露右股骨，于股骨中段用线锯将股骨横行切断，并将髓内固定针逆行插入骨折近端，从股骨大转子穿出，生理盐水洗净伤口后逐层缝合。大鼠经腹腔注射青霉素（100 000 IU/mL，1 mL/kg）3 d，术后清洁级环境下单笼饲养。

1.4 分组及给药 （1）分组：45只SD大鼠随机分为模型组（model组）、淫羊藿苷低剂量组（ICA-L组）和淫羊藿苷高剂量组（ICA-H组），每组15只。每组大鼠按照1.3的方法进行模型制备。（2）给药：给药方式：灌胃；给药时间：造模结束后1 d，连续给药28 d；给药次数：1次/d。model组：生理盐水4 mL/kg；ICA-L组：50 mg/kg的淫羊藿苷，给药剂量为4 mL/kg；ICA-H组：100 mg/kg的淫羊藿苷，给药剂量为4 mL/kg。

1.5 X线片观察各组大鼠骨折情况 各组大鼠分别于术后第1、4、7周进行X线片观察各组大鼠骨折线的变化及达到愈合的时间。

1.6 micro-CT检测各组大鼠的骨密度（BMD）和骨体积分数（BV/TV） 实验结束后，取出各组大鼠股骨并在4%多聚甲醛中固定24 h，使用micro-CT系统以50 kV和200 μA的9 μm分辨率分析大鼠的BMD、BV/TV。

1.7 ELISA 1）实验结束后，各组大鼠经3%戊巴比妥钠麻醉后，于心尖取血，置于离心管中，3000 r/min离心15 min，吸取上层血清。按照ELISA试剂盒说明书进行操作，用酶联仪在450 nm波长依序测定各孔的光密度（OD）值，根据OD值所绘制的标准曲线查出血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平。2）实验结束后，各组大鼠经3%戊巴比妥钠麻醉后，于心尖取血，置于离心管中，3000 r/min离心15 min，吸取上层血清。按照试剂盒说明书进行操作，检测血清中ALP活性、血清骨钙素、TGF-β1、VEGF和BMP-7的表达水平。

1.8 Western blotting 实验结束后，取各组大鼠骨折部位周围骨组织用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定总蛋白含量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂奶封闭1 h后，将PVDF膜与以下抗体在4 ℃孵育过夜：TGF-β1抗体（1∶1 000）、VEGF抗体（1∶1 000）、BMP-7 抗体（1∶1 000）和 GAPDH 抗体（1∶2 000）。随后，将PVDF膜用TBST洗涤3次，持续 5 min，并与 IgG-HRP（1∶5 000）孵育 1 h，用TBST洗涤3次，持续5 min。最后显影曝光，用Image-Pro Plus图像分析系统对蛋白条带的灰度值进行分析。

1.9 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行数据分析，正态分布数据资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 淫羊藿苷对各组大鼠股骨创伤愈合时间的影响 model组大鼠在第7周时骨折未能完全愈合，而ICA-L组和ICA-H组大鼠骨折愈合时间缩短，ICA-L组大鼠在第7周时骨折基本愈合，ICA-H组大鼠在第7周时骨折完全愈合，见图1。

图1 各组大鼠股骨创伤处X线片

2.2 淫羊藿苷对各组大鼠骨折愈合相关指标的影响 在model组观察到明显的骨折间隙，而ICA-L组和ICA-H组骨折间隙中形成了新的骨形态，见图2；与model组相比，ICA-L组和ICA-H组大鼠的BMD和BV/TV均升高，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表 1。

图2 各组大鼠股骨创伤处micro-CT图像

表1 各组大鼠骨折愈合相关指标的变化

2.3 淫羊藿苷对骨折大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-10含量的影响 与model组相比，ICA-L组和ICA-H组大鼠血清中IL-6、TNF-α的表达水平均下降，IL-10的表达水平升高，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表 2。

表2 各组大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-10的表达水平

2.4 淫羊藿苷对骨折大鼠血清中ALP活性的影响与model组相比，ICA-L组和ICA-H组大鼠血清中ALP活性升高，骨钙素含量增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 3。

表3 各组大鼠血清中ALP活性和骨钙素含量变化

2.5 淫羊藿苷对骨折大鼠血清中TGF-β1、VEGF和BMP-7表达水平的影响 与model组相比，ICA-L组和ICA-H组大鼠血清中TGF-β1、VEGF和BMP-7的表达水平均升高，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表 4。

表4 各组大鼠血清中TGF-β1、VEGF和BMP-7的表达水平

2.6 淫羊藿苷对大鼠骨组织中TGF-β1、VEGF和BMP-7蛋白表达的影响 与model组相比，ICA-L组和ICA-H组大鼠骨组织中TGF-β1、VEGF和BMP-7的蛋白表达水平均上调，差异有统计学意义（均P＜0.05），见图3和表5。

表5 各组大鼠骨组织中TGF-β1、VEGF和BMP-7蛋白的表达

图3 各组大鼠骨组织中TGF-β1、VEGF和BMP-7蛋白的表达

3 讨论

骨折是最常见的由创伤引起的对人体的伤害[11]。尽管骨骼具有自我重建和修复的能力，但是约10%～20%的骨折疾病中会发生骨骼不愈合和延迟愈合[12]。延迟的愈合通常会延长内部固定的时间，并大大增加发生强直的风险。因此，深入研究促进骨折愈合的机制极为重要。

淫羊藿苷是淫羊藿中的主要活性化合物之一，能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，还具有抗衰老等功效[13]。研究发现，淫羊藿苷能刺激大鼠骨髓基质细胞增生，增加骨钙素分泌，ALP染色阳性的数量，并以剂量依赖的方式增强ALP活性和钙沉积水平[14]。

炎症失调导致骨骼吸收增加和骨骼形成受到抑制。炎症细胞与骨愈合相关的细胞之间的串扰对骨骼的形成、修复和重塑至关重要[15]。免疫细胞浸润骨折部位并分泌炎性细胞因子，以刺激修复细胞进一步募集到骨折部位。参与骨折愈合的主要细胞因子包括促炎性因子（TNF-α，IL-1和IL-6）和抗炎性因子（IL-10），它们在炎症早期和愈伤组织重塑阶段都具有独特的激增模式[16]。本实验发现，骨折大鼠血清中IL-6、TNF-α的表达水平均上调，IL-10的表达水平下降，然而淫羊藿苷使骨折大鼠血清中IL-6、TNF-α的表达水平均下调，IL-10的表达水平上调。提示淫羊藿苷能调节骨折大鼠血清中炎症因子的表达。

骨折修复时，骨母细胞、血管骨内皮等均能合成ALP，分泌的ALP可以渗入血液，使血液中ALP水平增加[17]。骨钙素是一种多肽，在1,25-(OH)2D3刺激下由骨细胞合成和分泌，具有抑制异常的羟磷灰石结晶的形成，维持骨的正常矿化速率作用。血清骨钙素能反映近期骨细胞合成骨钙素和骨形成的情况[18]。本实验结果发现，骨折大鼠血清中ALP活性降低，骨钙素含量降低，然而淫羊藿苷使骨折大鼠血清中ALP活性提高，骨钙素含量增加。结果表明，淫羊藿苷使骨愈合时间缩短，提高ALP活性和骨钙素含量。

TGF-β1是TGF-β家族的成员，是一种参与骨重塑和骨折愈合的调节蛋白。TGF-β1在促进软骨形成，增加愈伤组织的形成和骨骼强度方面具有关键作用[19]。VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，研究发现，VEGF可通过不同的机制提高骨间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化、成熟，对骨生长和重建起重要作用[20]。BMP-7是转化生长因子-β超家族的成员，通过局部结缔组织干细胞和祖细胞上的受体以可溶性因子或基质结合蛋白的形式发挥作用，通过诱导间充质细胞分化、增殖和成骨细胞成熟，在骨形成和骨折愈合中起重要作用[21]。本实验发现骨折大鼠血清中TGF-β1、VEGF和BMP-7含量下降，骨组织中TGF-β1、VEGF和BMP-7蛋白表达水平下调，然而淫羊藿苷使骨折大鼠血清中TGF-β1、VEGF和BMP-7含量增加，骨组织中TGF-β1、VEGF和BMP-7蛋白表达水平上调。结果表明，淫羊藿苷能促进大鼠骨折愈合。

综上所述，淫羊藿苷使大鼠骨折愈合进程加快，其可能与减轻炎症反应、增加ALP和骨钙素含量，提高TGF-β1、VEGF和BMP-7的表达有关，为临床上治疗骨折提供新的方法。