丹酚酸B对糖尿病小鼠创面愈合及局部碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β1的影响

刘青武， 张金超， 陈 佳， 马慧可， 林 燕， 何秀娟， 李 萍

慢性皮肤溃疡是指一个月内接受正规治疗后未能痊愈，或无明显愈合倾向的创面，常见于糖尿病、烧伤、手术、外伤、细菌感染和下肢静脉曲张患者[1]。近年来，随着全球糖尿病发生率的不断增加，由其引起的糖尿病慢性皮肤溃疡因长期不愈、反复发作，成为患者致残的主要原因，是国内外医学界的关注热点[2]。创面修复是一个复杂的生物学过程，局部生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、转化生长因子 -β（TGF-β）、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor,PDGF）、角质形成细胞生长因子和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等生长因子的缺乏，是导致慢性创面愈合迟缓的重要因素[3]。bFGF具有促进新血管生成的作用，比PDGF和VEGF的血管生成作用更强大[4]，同时，TGF-β1也可发挥促进VEGF、PDGF等生长因子表达的作用，从而间接促进新生血管形成[5]，bFGF、TGF-β1在创面愈合过程中发挥着至关重要的作用。

丹参是一种常用的中草药，具有活血化瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功效，临床上广泛用于冠心病、心绞痛等心血管疾病和慢性皮肤溃疡的治疗[6]。丹酚酸B（salvianolic acid B,Sal B）是丹参中最具生物活性的水溶性成分之一，研究发现Sal B在体外能够抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）1、2和 9 活性[7]，发挥促创面愈合的作用，而Sal B对慢性创面内源性细胞因子调节作用的研究较少。本研究使用db/db糖尿病慢性皮肤伤口小鼠，观察Sal B对创面的修复及创面bFGF、TGF-β1表达的影响，从内源性细胞因子调节的角度探讨Sal B促进创伤修复的机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只雄性C57BLKS/J db/db糖尿病小鼠（8周，质量 36～42 g）和8只雄性C57BL/6J db/m小鼠（8周，质量18～22 g）购自北京大学医学部。实验动物合格证号：SCXK（京）2016-0010。饲养于首都医科大学附属北京中医医院、北京市中医研究所SPF级动物室，IVC鼠盒，无菌饲料单笼饲养，自由进食食物和水，恒温（22～24 ℃），湿度70%，光照周期12 h:12 h循环。动物实验经过首都医科大学附属北京中医医院动物伦理委员会批准，按照首都医科大学附属北京中医医院批准的指导方针饲养。

1.2 药物及试剂 Sal B（上海安奈德化学技术中心），bFGF（美国PeproTech公司），将药物溶于生理盐水，制备含药物明胶敷料，明胶海绵（南京金陵制药厂），一次性无菌敷料贴（山东东华医疗科技有限公司），苏木素-伊红（HE）染色液（北京中杉金桥公司）。TRNzol总RNA提取试剂（天根生化科技（北京）有限公司），第一链cDNA高效合成试剂盒（日本TaKaRa公司），BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo公司），b-FGF兔抗鼠多克隆抗体、TGF-β1兔抗鼠多克隆抗体、GAPDH鼠单克隆抗体均购自美国immunoway公司。

1.3 实验仪器 三诺公司血糖仪，TP1020型组织脱水机，EG1140H型包埋机，AUTOSTAINERXL型HE半自动染色仪（德国Leica公司），Axio Imager A2型蔡司光学显微镜（德国卡尔蔡司公司），7500 型荧光定量PCR仪（美国ABI公司），远红外激光成像系统（美国LI-COR公司），数码相机（日本佳能公司）。

1.4 实验方案 db/db小鼠属于瘦素蛋白受体缺失小鼠，由C57BL/Ks J近亲交配株常染色体隐性遗传衍化而来，出生6周后开始变胖、贪食，伴随高血糖，随后形成2型糖尿病模型[8]。与db/m小鼠相比，db/db小鼠体重较大，贪食、饮水多、尿多、大便溏稀、腥臭，行动迟缓[9]。故本实验选用雄性C57BLKS/J db/db小鼠作为2型糖尿病模型组，雄性C57BL/6J db/m非糖尿病小鼠作为空白组。动物适应性饲养1周，称其体重，使用血糖仪检测尾静脉全血血糖。所有动物使用腹腔注射戊巴比妥钠（60mg/kg）麻醉，备皮，使用皮肤打孔器在背部正中制作直径6 mm的全厚皮切除伤口，并使用数码相机拍摄创面照片。30只模型小鼠随机分为bFGF组（3.6 μg/mL）、Sal B组（1 mg/mL）和模型组，分别给予含bFGF、Sal B、生理盐水明胶海绵外敷于伤口，空白组给予含生理盐水明胶海绵外敷伤口，50 μL/只，以一次性无菌敷料贴包扎。隔日给药1次，并拍摄创面照片，于小鼠皮肤创面形成后第14天，处死后取伤口组织，一部分用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片；一部分立即放入液氮，用于RT-qPCR和Western blotting检测。

1.5 创面愈合率分析 通过拍照记录伤口大小，并使用Image-Pro Plus 6.0软件计算伤口面积。创面愈合率通过以下公式计算：创面愈合率（%） =（初始创面面积-未愈合创面面积）/初始创面面积×100%。

1.6 HE染色 在创面形成的第14天处死小鼠，切取伤口边缘3 mm的皮肤组织，并用10%甲醛溶液固定48 h，石蜡包埋切片，组织使用石蜡切片机切成5 μm厚的切片。切片用二甲苯脱蜡，水化后行HE染色，用光学显微镜拍摄照片。

1.7 RT-qPCR检测bFGF mRNA及TGF-β1 mRNA表达 采用Trizol试剂按照产品说明书步骤，提取创面皮肤总RNA，测定RNA的浓度，按反转录试剂盒说明书要求将RNA进行cDNA反转录。按定量PCR试剂盒说明书，取2 μl cDNA为模板，以β-actin为内参照，进行PCR扩增，各细胞因子的PCR引物见表1。扩增程序为：95 ℃，预变性30 s；共40个PCR循环（95 ℃变性5 s；60 ℃退火和延伸40 s），在延伸过程中收集荧光信号。PCR采用ABI 7500型荧光定量PCR仪进行，每个样本检测3个复孔，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

表1 各细胞因子的PCR引物

1.8 Western blotting检测bFGF、TGF-β1蛋白表达 皮肤创面组织采用RIPA裂解的方法提取总蛋白后，用BCA试剂盒进行定量。蛋白样品100 ℃，10 min变性后，取等量加入上样缓冲液进行SDSPAGE电泳，转膜至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，室温轻摇1 h，分别加入 bFGF（1:1 000）、TGF-β1（1:2 000）一抗，4℃过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5 000）在室温下孵育1 h，显影定影后将条带用Image J软件进行灰度值分析，以GAPDH为内参。

1.9 统计学分析 使用SPSS 20.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病小鼠的体重和血糖 与db/m小鼠（空白组）相比，db/db糖尿病小鼠体重和血糖均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且多食、多饮、多尿，行动迟缓。见表2。

表2 各组小鼠的体重和血糖比较

2.2 创面愈合率 创面形成后的3、7、14 d，模型组创面愈合率低于空白组（P＜0.05），Sal B组与bFGF组创面愈合率均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3、图1。

表3 各组小鼠创面的愈合率

图1 各组小鼠创面愈合情况比较

2.3 丹酚酸B对糖尿病小鼠创面组织病理学的影响 HE染色结果显示：创面形成后14天，各组均有新生表皮细胞，空白组创面可见大量成纤维细胞且排列规则，模型组表皮结构不完整，真皮成纤维细胞排列杂乱，较多炎性细胞浸润；bFGF组和Sal B表皮结构物完整，可见致密且规则的成纤维细胞，毛细血管丰富，见图2。

图2 Sal B对糖尿病小鼠创面组织病理学影响（HE,×200）

2.4 创面组织bFGF、TGF-β1mRNA表达 在创面形成后14天，模型组bFGF、TGF-β1 mRNA的表达水平低于空白组，bFGF组TGF-β1 mRNA表达高于模型组（P＜0.01），Sal B 组 bFGF、TGF-β1 mRNA的表达均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 各组小鼠bFGF、TGF-β1 mRNA表达水平比较

2.5 创面组织bFGF、TGF-β1蛋白表达 在创面形成后14天，模型组bFGF、TGF-β1蛋白的表达低于正常组，bFGF组、Sal B组bFGF、TGF-β1蛋白表达高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5、图3。

表5 各组小鼠bFGF、TGF-β1蛋白表达水平比较

图3 丹酚酸B对糖尿病小鼠创面组织bFGF、TGF-β1蛋白表达的影响

3 讨论

糖尿病溃疡多发生于下肢，是由于皮肤及血管在长期的高血糖环境下，局部血液循环障碍、周围神经病变、感染及骨骼结构变化引起的受力不均等因素，共同作用导致的下肢难愈性创面，溃疡可深达肌肉及骨骼，严重者可导致坏疽[2]。伤口愈合涉及角质形成细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和血小板的活化，会释放许多生长因子和细胞因子来协调和维持愈合[10]。生长因子影响内皮细胞、成纤维细胞和炎症细胞等多种细胞类型的增殖和趋化、迁移，也有助于防止细胞凋亡并影响细胞外基质的产生和重塑[5]，在创面愈合过程中发挥着重要的作用。

创面难以愈合的关键是瘀，如《外科秘录》云：“脏腑之气血不行，则脏腑之经络即闭塞不通，而外之皮肉即生疮疡”，瘀阻经络，防碍气血运行，阻碍气血生化之机，导致创面难以得到气血津液的濡养，虚瘀交杂，影响气血运行，造成溃疡增大，形成恶性循环。丹参是一味益气活血、通经活络的中药，《本草纲目》有“一味丹参，功同四物”的记载[11]，《本草汇言》云，丹参“补血生血，功过归、地，调血敛血，力堪芍药，逐瘀生新，性倍川芎”，说明丹参活血兼能生新。已有大量文献报道了丹参及其提取物在促进创面愈合中的积极作用，唐安梅等[12]采用丹参多酚酸盐联合胶原蛋白海绵治疗糖尿病足，能有效帮助患者改善症状，促进其足部伤口愈合，降低肉芽形成时间，从而提高治愈率。张文恺等[13]观察了黄芪丹参超微颗粒凝胶对大鼠创面愈合的影响，发现黄芪丹参超微颗粒凝胶能促进大鼠创面愈合，其作用可能与其上调创面修复组织中VEGF表达，从而促进毛细血管增殖有关。武奎安等[14]观察丹参注射液对普外科手术患者切口愈合的影响，结果观察组切口愈合时间短于对照组，术后1、3 d的血清C反应蛋白（CRP）、白细胞介素-6（IL-6）、全血黏度均低于对照组。证明了丹参能够促进术后伤口及糖尿病、压疮等慢性创面愈合。

丹酚酸是由丹参的根及根茎提取而得，丹酚酸是丹参中含量最丰富的水溶性物质，而丹酚酸B则是丹酚酸中含量最多、生物活性最强的化合物。结果表明丹酚酸B能够提高小鼠第3、7、14天的创面愈合率。组织学观察显示，在创伤后14 d，空白组创面明显缩小，创面可见大量成纤维细胞且排列规则，而模型组表皮结构不完整，真皮成纤维细胞排列杂乱，且较多炎性细胞浸润；bFGF阳性组和丹酚酸B组表皮结构物完整，可见致密且规则的成纤维细胞，毛细血管丰富，未见明显炎性细胞浸润，提示丹酚酸B可能通过促进成纤维细胞增殖、血管新生及降低创面的炎症水平而加速创面愈合。

bFGF是一个多肽分子，具有广泛的生物学活性，其通过与细胞表面酪氨酸激酶受体结合，激活细胞内RAS/MAP激酶通路、PI3K/AKT通路、PLC γ通路等多条信号通路，从而起到调控细胞存活、增殖、分化、迁移等多种功能[15]。同时，bFGF作为一种重要的促有丝分裂原，能够刺激中胚层、外胚层和内胚层来源的细胞增殖[16]。其不仅能促进表皮角质形成细胞增殖、迁移，修复皮肤屏障功能，还能促进真皮血管内皮细胞、成纤维细胞的增殖及分化，调控细胞外基质的分泌，并诱导其有序排列，加速肉芽组织生长及成熟[17]。bFGF临床常用于治疗烧烫伤创面、激光光电治疗后创面、黏膜溃疡、糖尿病皮肤溃疡等皮肤损伤[18]，故选做为本次实验的阳性药物及观察指标之一。

本实验结果显示，与模型组相比，bFGF组bFGF mRNA的表达无明显差异，而丹酚酸B组bFGF mRNA高于模型组，bFGF组、丹酚酸B组bFGF蛋白表达均高于模型组，说明外用bFGF组主要是通过提高外源性的bFGF生长因子浓度发挥促愈合的作用，外用丹酚酸B则具有促进内源性bFGF表达的作用。

TGF-β1是转化生长因子超家族的多肽成员，是一种执行多种细胞功能的蛋白，参与调控细胞生长、分化、增殖和凋亡。在创面修复中，TGF-β1作为成纤维细胞最强的趋化因子，能够趋化成纤维细胞向基底迁徙增殖，促进成纤维细胞分泌胶原蛋白及纤维连接蛋白形成临时的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，从而促进肉芽组织形成[19]。研究显示，在皮肤受创后1h就能够观察到TGF-β1被激活并表达，进而促进成纤维细胞的增殖和ECM的沉积，加速创面愈合[20]。TGF-β1降低减缓了ECM的形成，从而导致创面修复障碍。本实验结果显示，模型组TGF-β1mRNA、蛋白表达均低于bFGF组、Sal B组，bFGF组与Sal B组的TGF-β1 mRNA及蛋白表达差异无统计学意义，说明丹酚酸B也能够促进内源性TGF-β1的表达，张萍等[21]发现bFGF可TGF-β1/Smad3信号通路激活，促进糖尿病大鼠皮肤创面的愈合，表明外用bFGF可以促进内源性TGF-β1的表达，与本实验结果一致。

综上所述，丹酚酸B能促进db/db糖尿病皮肤小鼠慢性伤口愈合，其机制可能是通过升高创面组织内源性bFGF、TGF-β1的表达，促进成纤维细胞增殖、血管新生及降低创面的炎症水平，从而加速创面愈合。说明丹酚酸B不仅可以降低创面的高酶活性，还可以调控创面多种生长因子的表达，是慢性创面潜在的治疗药物。研究不足之处在于未观察丹酚酸B在创面形成早期对小鼠的创面组织学形态和生长因子调控作用的影响，将在今后的研究中完善。