仙灵骨葆胶囊对去势大鼠股骨组织形态计量学和OCN、Cbfα1 mRNA的影响

孙伟珊　霍少川　王晓东　孙平　王海彬

【摘要】 目的 探讨仙灵骨葆胶囊对去势大鼠股骨形态计量学和成骨相关基因骨钙素（OCN）、核心结合因子（Cbfα1） mRNA的影响。方法 50只6月龄雌性SD大鼠， 随机分为A组（作为空白对照）、B组

（作为模型）、C组（給予高剂量仙灵骨葆胶囊）、D组（给予低剂量仙灵骨葆胶囊）、E组[给予阿仑膦酸钠维D3片（福美加）]， 每组10只。药物干预3个月后， 采用X线显微断层显像仪检测左侧离体股骨骨密度（BMD）和骨小梁数量（TbN）， 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测右侧股骨组织OCN、Cbfα1 mRNA表达， 比较各组检测结果。结果 干预3个月后， B组左侧股骨BMD、TbN明显低于A组， 差异具有统计学意义（P<0.05）；与B组比较， C、E组左侧股骨BMD明显增高， E组左侧股骨TbN明显增高， 差异具有统计学意义（P<0.05）；与E组比较， C、D组左侧股骨BMD、TbN明显降低， 差异具有统计学意义（P<0.05）；五组左侧股骨BMD、TbN比较差异具有统计学意义（F=86.400、28.027， P<0.05）。干预3个月后， 与A组比较， B组右侧股骨Cbfα1、OCN mRNA表达量明显降低， 差异具有统计学意义（P<0.05）；与B组比较， C、D、E组右侧股骨Cbfα1 mRNA表达量明显增高（P<0.05）， C、E组右侧股骨OCN mRNA表达量明显增高， 差异具有统计学意义（P<0.05）；与E组比较， C组右侧股骨Cbfα1和OCN mRNA表达量明显增高（P<0.05）， D组右侧股骨Cbfα1 mRNA表达量明显降低， 差异具有统计学意义（P<0.05）；五组大鼠右侧股骨Cbfα1、OCN mRNA比较差异具有统计学意义（F=13.233、48.338， P<0.05）。结论 仙灵骨葆胶囊提高去势大鼠股骨BMD可能是通过提高OCN、Cbfα1 mRNA表达量发挥作用， TbN和BMD及成骨基因OCN、Cbfα1之间的关系尚需要进一步研究。

【关键词】 仙灵骨葆胶囊；去势大鼠；骨质疏松；骨钙素；核心结合因子

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.34.112

Effect of Xianling Gubao capsule on femoral histomorphometry and OCN and Cbfα1 mRNA in ovariectomized rats SUN Wei-shan， HUO Shao-chuan， WANG Xiao-dong， et al. First Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Guangzhou 510080， China

【Abstract】 Objective To discuss the effect of Xianling Gubao capsule on femoral histomorphometry and osteocalcin （OCN） and core binding factor （Cbfα1） mRNA in ovariectomized rats. Methods A total of 50 6-month-old female SD rats were randomly divided into group A （blank control）， group B （model）， group C （high-dose of Xianling Gubao capsule）， group D （low-dose Xianling Gubao capsule） and group E [alendronate sodium and vitamin D3 tablets （Fumega）]， with 10 rats in each group. After 3 months of drug intervention， the left femur bone mineral density （BMD） and trabecular number （TbN） were measured by X-ray microscopy， and the expression of OCN and Cbf α1 mRNA in right femurs was detected by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. The results of each group were compared. Results After 3 months of drug intervention， group B had obviously lower left femur BMD， TbN than group A， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with group B， group C and E had obviously higher left femur BMD and group E had obviously higher left femur TbN. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with group E， group C and E had obviously lower left femur BMD and TbN， and their difference was statistically significant （P<0.05）. Five groups had statistically significant difference in left femur BMD and TbN （F=86.400， 28.027， P<0.05）. After 3 months of drug intervention， group B had obviously lower right femur Cbfα1 and OCN mRNA expression than group A， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with group B， group C， D and E had obviously higher right femur Cbfα1 mRNA expression （P<0.05）， and group C and E had obviously higher right femur OCN mRNA expression. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with group E， group C had obviously higher right femur Cbfα1 and OCN mRNA expression （P<0.05）， and group D had obviously lower right femur Cbfα1 mRNA expression. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Five groups had statistically significant difference in right femur Cbfα1 and OCN mRNA expression （F=13.233， 48.338， P<0.05）. Conclusion Xianling Gubao capsule may increased femoral BMD in ovariectomized rats may by increasing expression of OCN and Cbf mRNA α1. The relationship between TbN and BMD and osteogenic genes OCN and Cbfα1 may be further studied.endprint

【Key words】 Xianling Gubao capsule； Ovariectomized rats； Osteoporosis； Osteocalcin； Core binding factor

骨质疏松（osteoporosis， OP）是一种全身性疾病， 其特征具有低骨量和骨微结构的退化， 并且导致骨的脆性增加和骨折风险[1]。世界卫生组织认为OP是仅次于心血管疾病的一个重要健康问题， 因此OP的预防及治疗具有重要的意义。目前经FDA批准应用于临床的抗OP药物虽然可有效降低OP性骨折的风险[2]， 但长期持续应用， 大多数都有一定的副作用[3]。中医药治疗OP能够缓解疼痛， 改善功能， 提高患者生活质量。仙灵骨葆胶囊属于中成药， 能够有效调节骨代谢， 改善骨骼强度， 防治OP[4]。为了进一步探讨仙灵骨葆胶囊的作用机制， 作者以骨形成相关基因骨钙素（osteocalcin， OCN）和核心结合因子（core binding factor apha 1， Cbfα1）为切入点， 探讨仙灵骨葆胶囊对去势SD大鼠股骨形态的影响， 以揭示仙灵骨葆胶囊防治OP的作用机制。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 实验动物 选用6月龄SPF级雌性SD大鼠50只， 平均体重（447.24±59.57）g， 购于广州中医药大学实验动物中心[许可证号：SYXK（粤）2013-0001]。所有SD大鼠均在恒温、恒湿的清洁环境中饲养， 室湿控制在23～25℃， 湿度50%左右， 标准饲料喂养， 自由摄食饮水， 通风良好， 适应喂养1周后建立骨质疏松模型。

1. 1. 2 实验药物 仙灵骨葆胶囊[国药集团同济堂（贵州）制药有限公司， 国药准字Z20025337]。福美加（杭州默沙东制药有限公司， 国药准字J20130085）。

1. 1. 3 主要仪器和试剂 X线显微断层显像仪（Skyscan公司）， 荧光定量PCR仪器（Bio-rad公司）， 多功能酶标仪（Thermo公司）， 离心机（eppendorf公司）， 逆转录仪（Bio-Rad公司）， 全能型凝胶成像系统（Bio-Rad公司）， 荧光定量PCR检测试剂盒（Genecopies公司）， 逆转录试剂盒（DBI公司）。引物设计为：OCN（上游：5-TGACTGCATTCTGCCTCTG-3， 下游：5-CGGAGTCTATTCACCACCTTAC-3）、Cbfa1（上游：CCAAGA

AGGCACAGACAGAA， 下游：5-CGGGACACCTACTCTCATAC

T-3）， GAPDH（上游：5-GCAAGGATACTGAGAGCAAGAG-3， 下游：5- GGATGGAATTGTGAGGGAGATG-3）， 由廣州四和生物科技有限公司提供。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 分组与造模 将50只大鼠随机分为A组（作为空白对照）、B组（作为模型）、C组（给予高剂量仙灵骨葆胶囊）、D组（给予低剂量仙灵骨葆胶囊）、E组（给予福美加）， 每组10只。五组大鼠用10%水合氯醛水溶液按 0.35 ml/100 g 腹腔注射麻醉大鼠， 在脊柱两侧约 1.5 cm 处作纵行切口， 切开皮肤、皮下组织及深筋膜， 在腹腔中找到梅花状的卵巢， B、C、D、E组切除卵巢， 并用 1 号丝线在卵巢底部结扎， 观察切口处渗血情况， 待无渗血时将脂肪回纳腹腔， 缝合背部筋膜层， 生理盐水冲洗后缝合皮肤；A组仅切除周围少量脂肪组织。造模后大鼠置于鼠笼中单独饲养， 术后连续3 d给予注射用青霉素钠（北京悦康凯悦制药有限公司， 国药准字H11020456）肌内注射（5万U/d）， 预防感染。

1. 2. 2 药物干预 造模3 d后， C、D组给药剂量分别为30.85、15.43 mg/（100 g·d）， 1次/d， 每周给药6 d；E组给药剂量为0.72 mg/（100 g·d）， 每周给药1次。

1. 2. 3 指标检测 干预3个月后， 处死各组大鼠， 取双侧股骨进行BMD、TbN及OCN、Cbfa1 mRNA检测。从-80℃冰箱中取出左侧离体股骨， 置于恒温水浴箱解冻后采用X线显微断层显像仪检测BMD和TbN。从液氮中取出右侧股骨， 取30～50 mg组织加入1 ml TRIzol Reagent， 用匀浆仪进行匀浆处理， 获取总RNA， 按照荧光定量PCR试剂盒说明书操作， 通过RT-PCT检测OCN、Cbfa1 mRNA表达。

1. 3 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 多组比较首先进行方差齐性检验， 方差齐采用单因素方差分析， 若不齐时采用非参数方差分析， 多组间两两比较采用单因素方差分析LSD法。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 五组大鼠左侧股骨BMD、TbN比较 干预3个月后， B组左侧股骨BMD、TbN明显低于A组， 差异具有统计学意义（P<0.05）；与B比较， C、E组左侧股骨BMD明显增高， E组左侧股骨TbN明显增高， 差异具有统计学意义（P<0.05）；与E组比较， C、D组左侧股骨BMD、TbN明显降低， 差异具有统计学意义（P<0.05）；五组左侧股骨BMD、TbN比较差异具有统计学意义（F=86.400、28.027， P<0.05）。见表1。不同干预方法的大鼠股骨BMD、TbN情况见图1。

2. 2 五组大鼠右侧股骨Cbfα1、OCN mRNA比较 干预3个月后， 与A组比较， B组右侧股骨Cbfα1、OCN mRNA表达量明显降低， 差异具有统计学意义（P<0.05）；与B组比较， C、D、E组右侧股骨Cbfα1 mRNA表达量明显增高（P<0.05）， C、E组右侧股骨OCN mRNA表达量明显增高， 差异具有统计学意义（P<0.05）；与E组比较， C组右侧股骨Cbfα1和OCN mRNA表达量明显增高（P<0.05）， D组右侧股骨Cbfα1 mRNA表达量明显降低， 差异具有统计学意义（P<0.05）；五组大鼠右侧股骨Cbfα1、OCN mRNA比较差异具有统计学意义（F=13.233、48.338， P<0.05）。见表2。endprint

3 讨论

OP的发病机制就是由于在骨重建的过程中失去了成骨细胞和破骨细胞的动态平衡， 出现骨吸收速度超过骨形成速度， 新生骨量少于被吸收骨量即发生负平衡， 导致骨总量的丢失， 引起骨质疏松症[5]。目前治疗的西药主要分为减少骨吸收药物、促进骨形成药物。阿仑膦酸钠是治疗OP的常用药物， 能快速缓解患者疼痛， 但是远期疗效较差[6]。目前开发的部分针对OP发病机制的靶向药物还处于临床试验阶段， 其安全性、有效性还需要长期临床观察[7]。

从中医角度来说， OP 属于“骨痿”范畴， 主要是由于肾虚引起， 造成肝、脾等脏器功能发生紊乱。仙灵骨葆胶囊主要由淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄等多味中药组成。方中， 淫羊藿具有补肾、坚筋骨的功效[8]；续断具有补肝肾、行血脉、强筋骨的功效[9]；丹参具有活血化瘀、理气止痛的功效；补骨脂具有温肾助阳、提高机体免疫的功效， 能够增强OCN mRNA 的表达[10]；地黄具有清热凉血、滋阴生津的功效。诸药共用， 具有活血化瘀、滋补肝肾之功效， 能增加骨强度， 改善局部血液供应， 通络止痛， 缓解患者的症状。本研究中， 仙灵骨葆胶囊高剂量和福美加明显提高去势大鼠BMD， 仙灵骨葆胶囊高、低剂量未提高TbN表达量， 福美加明显提高TbN表达量， BMD影响因素较多， 如组织容量、骨小梁厚度等， 中医药是否能够提高BMD的同时提高TbN表达量尚需要深入探讨。

OCN是由成熟的骨细胞和成骨细胞合成与分泌， 是成骨细胞的标志， 在骨组织矿化和成骨细胞分化增加时， OCN也随之特异增加[11]。张洪跃等[12]研究发现， 大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中OCN蛋白的表达随着补骨脂素浓度的升高而升高。张哲等[13]研究发现小鼠骨髓基质干细胞成骨诱导第7天时， 老鹳草素各剂量组OCN含量较对照组显著升高， 呈剂量依赖性。Cbfα1属于runt 结构基因家族的转录因子， 调控成骨细胞活性和分化， 是成骨细胞最早且最具有特异性的标志。李楠等[14]研究发现巴戟天水提物与巴戟天多糖均能显著提高成骨细胞Cbfα1mRNA 的表达。刘国岩等[15]研究骨碎补对大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化及Cbfα1表达的影响， 结果发现体外中药骨碎补可促进大鼠BMSCs 增殖及成骨分化， 加强Cbfα1 表达。巴戟天和骨碎补属于补肾阳中药， 以上研究说明补肾中药能够促进和OCN、Cbfα1表达量。本研究结果显示， 干预3个月后， B组左侧股骨BMD、TbN明显低于A组， 差异具有统计学意义（P<0.05）；与B组比较， C、E组左侧股骨BMD明显增高， E组左侧股骨TbN明显增高， 差异具有统计学意义（P<0.05）；与E组比较， C、D组左侧股骨BMD、TbN明显降低， 差异具有统计学意义（P<0.05）；五组左侧股骨BMD、TbN比较差异具有统计学意义（F=86.400、28.027， P<0.05）。干预3个月后， 与A组比较， B组右侧股骨Cbfα1、OCN mRNA表达量明显降低， 差异具有统计学意义（P<0.05）；与B组比较， C、D、E组右侧股骨Cbfα1 mRNA表达量明显增高（P<0.05）， C、E组右侧股骨OCN mRNA表达量明显增高， 差异具有统计学意义（P<0.05）；与E组比较， C组右侧股骨Cbfα1和OCN mRNA表达量明显增高（P<0.05）， D组右侧股骨Cbfα1 mRNA表达量明显降低， 差异具有统计学意义（P<0.05）；五组大鼠右侧股骨Cbfα1、OCN mRNA比较差异具有统计学意义（F=13.233、48.338， P<0.05）。说明仙灵骨葆胶囊能够提高OCN、Cbfα1 mRNA表达量， 与上述研究一致。

综上分析， 仙灵骨葆胶囊能够提高去势大鼠BMD、OCN和Cbfα1 mRNA表达量， 但未发现提高TbN。因此有理由相信仙灵骨葆胶囊能够提高去势大鼠BMD可能是通过提高OCN、Cbfα1 mRNA表达量发挥作用， TbN和BMD及成骨基因OCN、Cbfα1之间的关系尚需要进一步研究。

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[收稿日期：2018-10-18]endprint