茵陈赤小豆汤治疗深静脉血栓形成的网络药理学机制研究

王玉涛， 周苗苗

深静脉血栓形成（deep venous thrombosis,DVT）是常见的血管外科疾病，血栓一旦脱落，可随血液回流栓塞肺动脉，导致肺栓塞（pulmonary embolism, PE），二者统称为静脉血栓栓塞症（venous thromboembolism, VTE）。据统计，约 10%～30%的VTE患者在确诊后30天内死亡，大多数死亡病例为PE患者[1]。DVT属祖国医学“恶脉”“筋瘤”范畴，国家中医药管理局制定的《中医病证诊断疗效标准》根据DVT的特点将其命名为“股肿病”。现代医家认为，“湿”“热”“瘀”是DVT发病的主要病机[2]。济南市中医医院李廷来教授根据其证候特点，首创茵陈赤小豆汤[3]，治疗DVT疗效确切，应用广泛[4-7]。但目前的研究仅限于临床应用，其具体作用机制尚不明确。网络药理学（network pharmacology, NP）是当下研究中医药作用机制的新兴学科[8]，可运用“药物-靶点-通路-疾病”的信息挖掘和网络构建方法，探索药物与疾病之间的相互作用的内在机制。本研究在网络药理学理论的指导下，探讨茵陈赤小豆汤有效成分治疗DVT的作用机制，旨在为中医药治疗深静脉血栓形成的研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1 茵陈赤小豆汤药物成分筛选 茵陈赤小豆汤由茵陈、赤小豆、薏苡仁、泽泻、苍术、黄柏、苦参、防己、佩兰、木通、白蔻、生甘草组成。检索西北农林科技大学设计开发的中药系统药理学数据库和分析平台（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP），对茵陈赤小豆汤所含药物的所有成分进行挖掘整理[9]。药代动力学参数是评价药物在体内代谢的重要指标。药物口服生物利用度（oral bioavailability, OB）是指药物经口服后被吸收进入人体循环的速度与程度，OB值越高越有成为治疗药物的潜力；药物相似度（drug-likeness, DL）是指化合物与已知药物的相似性。以OB≥30%、DL≥0.18为条筛选件[10]，过滤获得茵陈赤小豆汤药物成分，建立数据库。

1.2 茵陈赤小豆汤药物成分靶点收集 利用TCMSP数据库检索茵陈赤小豆汤药物成分的作用靶点并导出。UniProt（http://www.uniprot.org/）是蛋白质序列和注释数据的综合数据库，包含1.2亿种蛋白质的序列和注释信息[11]。以UniProt Knowledgebase（UniProt KB）数据库中“智人（Homo sapiens）”的注释信息为参照，利用perl语言工具（http://www.perl.org/）校正预测的靶点名称。

1.3 DVT靶点的获取及收集 GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库是一个可以分析人类基因数据的综合数据库，该数据库集成了约150个基因网络数据库资源，内容涵盖基因组、转录组、蛋白质组、遗传等信息[12]。人类在线孟德尔遗传平台（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）是一个记录人类基因与遗传表型的数据库[13]。利用Pubmed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）中的“医学主题词表”（Medical Subject Headings, MeSH）功能，确定深静脉血栓形成的主题词。使用上述2个数据库，将从Pubmed查询到的深静脉血栓形成的主 题 词“Venous Thrombosis”“Phlebothrombosis”“Phlebothromboses”“Venous Thromboses”“Deep Vein Thrombosis”“Deep Vein Thromboses”“Deep-Venous Thrombosis”“Deep-Venous Thromboses”“Deep-Vein Thrombosis”“Deep-Vein Thromboses”“Deep Venous Thrombosis”“Deep Venous Thromboses”作为关键词，检索、合并、去重后，获得与深静脉血栓形成相关的靶点。

1.4 药物成分-疾病靶点网络的构建 使用Cytoscape 3.7.2软 件（http://www.cytoscape.org）构建“药物成分-疾病靶点”关系网络。以网络节点度值（Degree）和中介中心度（Betweenness centrality）为筛选条件，挖掘网络核心节点。

1.5 关键靶点蛋白相关作用（protein-protein interaction, PPI） 网络的构建使用STRING数据库（https://string-db.org）预测靶点之间的相互作用。STRING数据库系统可对通过不同方式获得的预测结果进行评分，分值越高，表示PPI结果的置信度越高。本研究利用STRING数据库的“Multiple Proteins”检索功能，设定“物种”为“智人”，将茵陈赤小豆汤干预DVT的潜在靶点导入系统检索，设定评分分值＞0.9，构建PPI网络，并获得节点度值等反映靶点蛋白相互关系的信息。

1.6 关键靶点信号通路富集分析 以R语言为平台，借助Bioconductor[14]和Cluster Profiler工具[15]进行信号通路富集分析。以P＜0.05为条件进行信号通路筛选，并将结果可视化。

2 结果

2.1 茵陈赤小豆汤药物成分筛选 通过TCMSP数据库检索并以OB≥30%和DL≥0.18为条件进一步筛选、去重后，得到茵陈赤小豆汤药物成分，见表1。

表1 茵陈赤小豆汤药物的有效成分

2.2 茵陈赤小豆汤干预DVT的靶点 检索得到茵陈赤小豆汤药物有效成分作用靶点2559个，去重后得到靶点245个。检索收集DVT相关靶点1376个，去重后得到靶点1291个。运用生物信息学与进化基因组学网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）的韦恩图绘制功能，将茵陈赤小豆汤药物成分作用靶点和DVT相关靶点取交集，获得茵陈赤小豆汤干预DVT的潜在靶点119个，并绘制韦恩图（图1）。

图1 茵陈赤小豆汤作用靶点及DVT相关靶点韦恩图

2.3 药物成分-疾病靶点网络构建 利用网络图形化工具Cytoscape 3.7.2对茵陈赤小豆汤干预DVT的作用靶点进行关系网络绘制和统计，得到网络关系图，网络中的节点（Node）代表茵陈赤小豆汤药物有效成分、DVT相关靶点；边（Edge）代表药物成分-疾病靶点之间的连接。整个网络构建并展示了“药物成分-疾病靶点”之间的联系（图2）。网络节点度值（Degree）和中介中心度（Betweenness Centrality, BC）反映了节点在网络中核心度的高低，度值越高，表明该节点在网络中就越重要。本研究运用Cytoscape软件中的cytoNCA插件[16]，按Degree值和BC值大小排序筛选新处方药物干预STP的核心成分和靶点，并构建网络图（见图3）。结果表明，槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）、木犀草素（MOL000006）等有效成分以及PTGS1、PTGS2、HSP90AA1等靶点度值较高，说明这些有效成分和靶点在网络中的作用显著，是与其他靶点互通的纽带。

图2 茵陈赤小豆汤干预DVT的药物成分-疾病靶点网络关系

图3 核心成分及靶点网络图

2.4 新处方药物干预STP靶点 PPI网络分析结果将茵陈赤小豆汤干预DVT的靶点上传至STRING数据库，设定置信度评分分值＞0.9，将独立于网络之外的蛋白予以排除，得到PPI网络（图3）。该网络共包含节点119个，边2310条，平均度值为35.8。网络中的“节点”代表靶点，“边”表示靶点间的相互作用关系。

图4 PPI网络图

2.5 关键靶点基因生物功能及通路分析 以Bioconductor和Cluster Profiler为平台分析新处方药物干预STP靶点的KEGG pathway信号通路富集分析。结果表明，KEGG通路富集得出162条结果，有118条通路的P值＜0.01。以P值和基因的数量为筛选条件，取前30位的通路进行分析并可视化，结果表明，基因显著富集在糖尿病AGE-RAGE、IL-17、TNF、HIF-1、C型凝集素受体、松弛素等信号通路上（图5）。

图5 关键靶点KEGG通路富集分析

3 讨论

本研究以网络药理学理论为指导，构建了茵陈赤小豆汤干预DVT的药物成分-疾病靶点网络，经拓扑分析表明，槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）、木犀草素（MOL000006）等可能是茵陈赤小豆汤干预DVT的主要有效成分。槲皮素、木犀草素及山奈酚都属于黄酮类化合物。有动物实验研究表明，连续7 d给予大鼠6 mg/kg的槲皮素可抑制血小板功能并减少血栓形成[17]，也有研究表明槲皮素有可能对过氧化氢（H2O2）诱导血管内皮祖细胞产生的氧化应激损伤起到修复作用[18]；槲皮素也有抑制血小板聚集和5-羟色胺（5-HT）释放的作用，对二磷酸腺苷、凝血酶和血小板活化因子所引起的血小板聚集均有明显抑制作用[19]。木犀草素是一种天然的黄酮类化合物，存在于多种植物中，有研究表明，木犀草素可以通过抑制活性氧的生成及减少一氧化碳的生成来降低机体的氧化应激反应[20-21]；山奈酚又名百蕊草素Ⅲ，具有抗氧化、抗炎、抗病毒等药理作用[22-23]。

经网络拓扑分析，PTGS1、PTGS2、HSP90AA1等可能茵陈赤小豆汤干预DVT的核心靶点。前列腺素内过氧化物合酶（prostaglandin endoperoxide synthase, PTGS），又称环加氧酶（cyclooxygenase,COX），在前列腺素（prostaglandins, PG）合成过程中发挥着关键作用。PTGS有两种同工酶：结构型PTGS1和诱导型PTGS2，也叫COX-1和COX-2。相关研究表明结构型COX-1通过调节血栓素A2（TXA2）的生成来调整血小板的聚集与活化[24]；而COX-2能够催化产生前列腺素I2（PGI2），PGI2是较强的血小板聚集抑制剂，它能够抑制血小板聚集，舒张血管[25]。因此抑制COX-1的活性，增强COX-2的活性，可以很有效的抑制血小板聚集，从而可以减少机体内血栓的形成。热休克蛋白90（heat shock proteins 90,HSP90）是热休克蛋白家族中的一员，属于热应激蛋白质，相关研究表明，HSP90在细胞的生长、增殖、迁移和凋亡等方面有着重要调节作用[26-27]；吴峰等[28]通过动物实验表明，当HSP90的表达降低，会是细胞停滞在细胞周期G1期，从而引起细胞沉积，导致血栓形成。

信号通路富集分析结果表明，糖尿病糖基化终末产物与糖基化终末产物受体（AGE-RAGE）、白细胞介素（IL）-17、肿瘤坏死因子（TNF）、低氧诱导酶因子-1（HIF-1）、C型凝集素受体和松弛素等信号通路是茵陈赤小豆汤干预DVT的主要通路。糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGE）是指在非酶促条件下，一些大分子物质（蛋白质、氨基酸、脂类或核酸）的游离氨基和还原糖的醛基经过一系列进化后产生的一组稳定的终末产物。糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation endproducts, RAGE）是一种膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，是AGE最重要的受体之一。相关研究表明，大量的AGE积累会影响机体内蛋白质性能，影响血管收缩和舒张功能，产生病理变化，引起体内血栓形成、动脉粥样硬化及微小血管病变等一系列变化[29]。当RAGE与AGE结合后，能引起机体的氧化应激反应，在一定程度上还能减少AGE的含量[30]。TNF主要由活化的巨噬细胞，NK细胞及T淋巴细胞产生，于1975年被Carswell等命名。实验研究表明来源于巨噬细胞的TNF-α能够促进血小板聚集，增强机体凝血功能，从而使血栓形成[31]。IL-17是已发现的白细胞介素之一，由CD4+T细胞分泌。研究表明IL-17是早期启动T细胞诱导炎症反应发生的炎性因子，可以通过增加前炎性因子的释放来扩大炎症反应[32]。HIF-1是一种异源二聚体，主要由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成。研究表明NOS可以诱导HIF-1活化，HIF可以在缺氧状态下，能够减少缺血管损伤[33]。也有研究表明HIF-1α可以通过抑制NF-κB生成以降低炎症反应[34]。C型凝集素受体是一类可以和糖类结合的蛋白质，是固有免疫系统中的重要模式识别受体。国外研究表明C型凝集素受体中的非经典C型凝集素受体（non-classic C-type lectinreceptor,NCLR）如果减少，会导致机体出血时间增加[35]。松弛素（relaxin, RLX）是属于胰岛素家族中的一种多肽类激素，是对血管具有重要作用的激素。汪婷等[36]通过实验表明松弛素可以通过抑制血管紧张素Ⅱ的表达，减少血管细胞外膜成纤维细胞的生成，从而减少血管纤维化，抑制血管收缩。多项实验研究表明内皮细胞的有无对松弛素舒张血管有着显著影响[37-38]；也有研究表明，松弛素可以通过调节血管内收缩因子，减少内皮细胞在血管壁中的附着，从而降低炎症反应、保护血管内皮及抑制血栓形成[39-40]。

综上所述，本研究运用网络药理学的研究方法，对茵陈赤小豆汤干预DVT的机制进行挖掘，结果表明，槲皮素、木犀草素、山奈酚有效成分可能通过介导糖尿病AGE-RAGE、IL-17、TNF、HIF-1、C型凝集素受体和松弛素等信号通路发挥干预DVT的作用。上述结果可为深静脉血栓形成的治疗提供新的思路。但由于目前数据库收集的信息尚不全面，药物有效成分及其靶点的筛选过程会受到研究者的主观态度影响，而且药物有效成分在体内的代谢过程也存在诸多影响因素，本研究的结果会存在一定的局限性，茵陈赤小豆汤治疗DVT的机制有待实验验证。