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基于网络药理学探讨枳实薤白桂枝汤与人参汤“皆主胸痹”的科学内涵

2021-06-24王梦薇张迪陆瑞敏王文雅张雪丽陈萌

环球中医药 2021年6期
关键词:枳实薤白桂枝汤

王梦薇 张迪 陆瑞敏 王文雅 张雪丽 陈萌

心绞痛(angina pectoris)主要是由冠状动脉痉挛或阻塞、心肌暂时缺血或缺氧所引起的心血管疾病,相当于中医的“胸痹”,是临床多发疾病,其发病率呈现逐年增高的趋势[1]。心绞痛如果得不到有效的缓解和治疗,随时可出现心律失常、心肌梗死或心力衰竭等恶性并发症。西药治疗心绞痛存在耐受性差、耐药性强、不良反应重等问题,中医药在治疗心绞痛方面具有特有优势[2]。枳实薤白桂枝汤和人参汤[3-4]治疗心绞痛在临床上已被广泛使用,并取得了显著的疗效。

《金匮要略》云:“胸痹心中痞,留气结在胸,胸满,胁下逆抢心,枳实薤白桂枝汤主之;人参汤亦主之。”历代医家对枳实薤白桂枝汤与人参汤皆主胸痹的认识众说纷纭。一部分学者认为,两复方适用于胸痹病的不同阶段,枳实薤白桂枝汤应用于急性期,而人参汤则应用于缓解期;一部分学者认为该条所述的胸痹病分为虚实二证,偏于实者用枳实薤白桂枝汤,偏于虚者用人参汤;也有学者认为两方皆主胸痹是为体现仲景“心胃同治”的思想[5]。目前,针对两方治疗胸痹的对比研究多停留在理论或临床研究,其药物活性成分以及作用机制的研究相对较少,值得进一步深究。

网络药理学是基于“多成分—多靶点—多途径”综合调控的中药机理研究方法,能够系统的反映药物对疾病网络的干预机制,从整体探索中药和机体的作用关系[6]。本研究采用网络药理学的方法,构建枳实薤白桂枝汤和人参汤相关的网络靶点及相关活性成分,通过分析两复方治疗心绞痛的关键靶点、蛋白以及相关通路,为进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 枳实薤白桂枝汤和人参汤中药物活性成分的筛选与收集

枳实薤白桂枝汤由枳实、厚朴、薤白、桂枝、栝蒌实5味药组成,人参汤由人参、甘草、干姜、白术4味药组成。将上述9味药分别输入TCMSP(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)[7]和TCMID(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)检索并收集所有单位药物的活性成分。借助TCMSP平台的ADME参数,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和药物相似性(drug-likeness,DL)≥0.18为条件,筛选单位药物的活性成分。

1.2 枳实薤白桂枝汤和人参汤中药物潜在作用靶点的预测

应用TCMSP分析平台,在线搜索枳实薤白桂枝汤和人参汤单味药物活性成分的靶点信息,应用Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)和Drugbank数据库检索已筛选活性成分的靶点,限定物种为人,剔除没有靶点或靶点信息不明确的化合物。使用UniProt(http://www.uniprot.org)进行靶点—基因名转换,将检索得到基因名校正为官方名称(official symbol)。

1.3 心绞痛相关靶点筛选

预测疾病靶点的信息参考6个疾病数据库:HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、OMIM(http://omim.org/)[8]、TTD (http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)[9]、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)[10]、DisGeNET(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu)、HPO(https://hpo.jax.org/app/),以“Angina Pectoris”作为关键词进行搜索,分析对比后,归纳整理对心绞痛有明确作用的基因。

1.4 活性成分—药物靶点、活性成分—疾病作用靶点网络构建及拓扑分析

根据上述筛选以及预测结果,将两复方的活性成分所对应的靶点基因与心绞痛相关的靶标基因进行匹配,使用 Cytoscape3.7.1软件构建如下网络:(1)枳实薤白桂枝汤及人参汤的活性成分—药物潜在靶点网络图;(2)枳实薤白桂枝汤及人参汤治疗心绞痛的活性成分—疾病作用靶点网络图。运用Network Analyzer工具进行拓扑分析,通过计算网络中各节点的介数中心性(betweenness centrality)以及度(degree),评价分析枳实薤白桂枝汤和人参汤的关键化合物以及靶点。

1.5 蛋白质相互作用网络构建及分析

使用String数据库(https://string-db.org/)[11]进行共有靶点蛋白质—蛋白质相互作用网络(PPI)、枳实薤白桂枝汤特有治疗心绞痛网络图(PPI)、人参汤特有治疗心绞痛网络图(PPI),设置物种为“Homo sapiens”(人),置信度得分≥0.4,获得最终的蛋白质相互作用网络图,从共有靶点与特有靶点不同属性角度解释“同病异治”的科学内涵。

1.6 生物过程通路富集分析

运用R 3.6.1软件对交集靶点基因进行GO生物过程以及KEGG信号通路分析,ClusterProfiler是基于R语言开发的Bioconductor软件包,可以对基因集合或基因cluster进行功能聚类的统计分析和可视化。设定pvalueCutoff=0.05,进行GO以及KEGG通路富集分析,筛选排名前二十的GO生物学途径,绘制柱状图和KEGG通路绘制气泡图,以找到枳实薤白桂枝汤和人参汤治疗心绞痛共有靶点相关的重要信号通路。

2 结果

2.1 枳实薤白桂枝汤和人参汤中药物活性成分筛选及作用靶点预测

借助TCMSP、Swiss Target Prediction和Drugbank数据库,筛选高可信度的基因作为候选靶点。筛选结果如下:枳实薤白桂枝汤的药物活性成分和靶点数分别是43个和200个;人参汤的药物活性成分和靶点数分别是111个和212个(表1)。

表1 枳实薤白桂枝汤和人参汤成分—靶点的基本信息

通过对比分析,两复方共有的药物活性成分和靶点数分别是4个和183个。枳实薤白桂枝汤和人参汤的成分—靶点网络总共包括379个节点,1891条边,其中红色代表人参汤的活性成分,绿色代表枳实薤白桂枝汤的活性成分,紫色代表两个方中共有的活性成分,橙色代表人参汤潜在的作用靶点,黄色代表枳实薤白桂枝汤潜在的作用靶点,蓝色代表两复方共同的作用靶点,每条边表示活性成分与靶点之间的相互作用关系。从靶点角度来说,两复方中存在多成分多靶点共同作用的机制,符合中药复方的特点(图1)。

图1 枳实薤白桂枝汤和人参汤成分—靶点网络图

2.2 枳实薤白桂枝汤和人参汤治疗心绞痛作用靶点分析

通过全面查找6个疾病数据库,共筛选得到219个相关的靶点,进一步将药物作用靶点与心绞痛疾病靶点进行关联。枳实薤白桂枝汤和人参汤共有的183个靶点中有31个与心绞痛相关,占心绞痛疾病靶点数目的14.16%,而枳实薤白桂枝汤和人参汤与心绞痛相关的特有靶点均只有1个(图2),说明两复方治疗心绞痛的生物学基础及其相似。枳实薤白桂枝汤中与心绞痛相关的活性成分有22个,人参汤中有67个,分别占该复方总活性成分的51.16%和60.36%。此外,两复方共有的活性成分仅为4个,而与心绞痛相关的则有3个,说明两复方治疗心绞痛的作用机理可能存在高度的相似性。两复方治疗心绞痛的共有靶点中有30个可被naringenin、quercetin、beta-sitosterol三个共有活性成分作用,表明上述三个活性成分是两复方治疗心绞痛的关键药物成分。三种成分主要存在于枳实、薤白、桂枝和甘草、人参、干姜6味药当中,一定程度上反映了这6味药在治疗心绞痛相关疾病中的关键作用。

图2 药物潜在作用靶点与疾病靶点的韦恩图

2.3 网络构建及拓扑分析

借助Cytoscape 3.7.1软件对药物活性成分—疾病作用靶点进行网络可视化,得到了包含122个节点,356条边的网络,其中黄色代表两复方治疗心绞痛的共同靶点,绿色代表人参汤治疗心绞痛的特有靶点,粉色代表枳实薤白桂枝汤治疗心绞痛的特有靶点,蓝色代表两复方治疗心绞痛的共有活性成分,青色代表人参汤治疗心绞痛的特有活性成分,紫色代表枳实薤白桂枝汤治疗心绞痛的特有活性成分。每条边则表示活性成分与靶点之间的靶向作用关系(图3)。在网络中,节点度代表节点相连的边数,以betweenness centrality和degree来评估节点在网络中的重要性,筛选连接活性成分或靶点较多的节点,这些节点在整个网络中起到了枢纽的作用,可能为关键的活性成分或者靶点。在枳实薤白桂枝汤和人参汤治疗心绞痛共有靶点相互作用的网络图中,靶点度排名靠前的有SCN5A、ADRB2、KCNH2、PON1、APOB等,分别与67、53、27、6、4个药物活性成分发生相互作用。枳实薤白桂枝汤和人参汤治疗心绞痛共有靶点相互作用网络中拓扑属性分析前20位的靶点见表2。

表2 枳实薤白桂枝汤和人参汤共有靶点的拓扑参数

图3 枳实薤白桂枝汤和人参汤活性成分—作用靶点—疾病相互作用网络图

2.4 枳实薤白桂枝汤和人参汤治疗心绞痛的蛋白质—蛋白质作用网络

使用String数据库,构建两复方治疗心绞痛共有靶点的蛋白质—蛋白质相互作用网络图,该网络含有31个节点,203条边,平均节点degree值为13.1(图4)。以degree值作为该网络核心基因分析的主要参考依据,筛选排名前15名的共有靶基因,其中度排名最靠前的6个分别是IL-6、VEGFA、CCL2、IL-10、IL-1B、SERPINE1(图5)。另外,枳实薤白桂枝汤治疗心绞痛特有靶点的相互作用网络图有32个节点,220条边;人参汤治疗心绞痛特有靶点的相互作用网络图有32个节点,207条边。

图4 枳实薤白桂枝汤和人参汤治疗心绞痛共有靶点蛋白质—蛋白质相互作用网络

图5 枳实薤白桂枝汤和人参汤治疗心绞痛共有靶点(TOP15)

2.5 枳实薤白桂枝汤和人参汤治疗心绞痛共有靶点的KEGG通路分析

运用R3.6.1对枳实薤白桂枝汤和人参汤治疗心绞痛的共有靶点进行KEGG信号通路分析。排除宽泛的通路,筛选排名前20的通路(表3)。本研究发现枳实薤白桂枝汤和人参汤治疗心绞痛的共有靶点富集于HIF-1信号通路、IL-17信号通路、细胞因子及其受体的相互作用、NF-κB信号通路、Th17细胞分化上。这些信号通路被证明与心绞痛密切相关。

表3 枳实薤白桂枝汤和人参汤治疗心绞痛共有靶点KEGG通路分析

2.6 两复方治疗心绞痛核心靶点的KEGG通路分析

通过R 3.6.1软件分别对两复方治疗心绞痛的核心靶点进行KEGG通路的富集分析,枳实薤白桂枝汤治疗心绞痛靶点的代谢通路前20名参见图6;人参汤治疗心绞痛靶点的代谢通路前20名参见图7。结合上述分析可以看出富集的通路大致相似,表明两复方治疗心绞痛的作用机制可能主要依赖于其中的共有活性成分。

图6 枳实薤白桂枝汤治疗心绞痛作用靶点的KEGG通路分析

图7 人参汤治疗心绞痛作用靶点的KEGG通路分析

3 讨论

网络药理学是以中医药理论为指导,体外虚拟筛选中药复方活性物质,潜在作用靶点以及通路的现代化研究方法,其研究体现的整体性特点与中医的整体观念相契合,是中药复方研究中的重要方法之一。网络药理学在中药复方的作用机制、药效物质基础、配伍规律、复方优化、“效—毒”网络等研究中均有广泛应用,被认为是近代生物医药研究的哲学观念与研究模式的革命性转变[12-13]。

本研究发现,枳实薤白桂枝汤和人参汤中共有的活性成分为4个,共有的靶基因187个,其中属于共有活性成分对应的靶基因有167个。两复方治疗心绞痛的共同靶基因有31个,其中属于共有活性成分的靶基因有30个,说明3个共有活性成分在治疗心绞痛方面最为关键。上述靶基因的主要作用为调控炎症反应、保护血管内皮、调节离子通道等。炎症相关因子是心血管疾病的中药预测指标[14],不稳定型心绞痛患者机体炎症反应活跃,在两复方治疗心绞痛的靶点中IFNG、IL-10、IL-6等[14]均与炎症反应密切相关,提示两复方可能通过调控炎症反应治疗心绞痛。SCN5A是心脏钠离子通道编码基因的家庭成员,可以编码心肌钠离子通道的成孔离子传到的α亚基[15]。大量研究发现,SCN5A的突变与心房颤动、心律失常等多种心脏疾病密切相关[16-17]。ADRB2是G蛋白偶联肾上腺素受体家族成员之一,可以特异性的结合内源性配体,从而产生生物效应[18]。ADRB2在心血管平滑肌细胞、心肌细胞中广泛表达,而ADRB2的突变可以导致心肌梗死或冠状动脉疾病[19]。KCNH2是编码快速激活延迟整流钾离子通道蛋白α亚单位的基因,研究发现,该基因的突变是导致心律失常的重要基础[20]。两复方尚可调控PON1、APOB、LDLR等血脂代谢相关基因,APON1可降低低密度脂蛋白水平[21],LDLR基因的缺失会导致动脉粥样硬化斑块的形成[22],上文提到的ADRB2也被证明在脂类代谢中具有重要作用[23]。此外,大量研究表明芳香烃受体信号通路(AHR信号通路)与心血管疾病密切相关,该通路可以影响心脏功能、血管的发育以及调节血压[24],而在本研究中,与该条通路相关的基因包括AHR、CYP1A2、CYP1A1、CYP3A4、AHR信号通路的靶基因细胞色素P450超家族成员(如CYP1A1)、还原型辅酶Ⅱ、醌氧化还原酶和乙醛脱氢酶,这些靶基因与氧化代谢反应密切相关,AHR基因的缺失还会影响VEFG等基因的表达。这些都提示了该通路可能是两复方治疗心绞痛的重要机制之一。此外,两复方的共有靶点较多,但与心绞痛相关的靶点仅占14.16%,说明两复方可能在其他疾病中仍存在“同病异治”的情况,临床上可进一步探索。

枳实薤白桂枝汤特有靶点为金属蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1),该基因是基质金属蛋白酶-9(matrix metallo protein-9,MMP-9)活性的主要抑制物,MMP-9是粥样斑块破裂的中药促进因素,两者间的平衡是维持细胞外基质完整性和改善血管重构的关键。因此,TIMP1可能通过调控MMP-9,从而抑制斑块破裂[22]。而人参汤的特有靶点为单胺氧化酸A(monoamine oxidase A,MAOA),该基因对心绞痛的作用机制研究较少,但有大量研究表明,该基因与对5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、NE等具有较高亲和力[25],5-HT受体不仅可以调控心脏伤害性感受以及早期动脉粥样硬化,因此MAOA可能通过作用于5-HT,从而在心绞痛的治疗中发挥作用。以上所述从侧面说明了枳实薤白桂枝汤用于胸痹急性期,而人参汤用于胸痹缓解期(调养期)的说法。

KEGG通路的富集结果显示,两复方治疗心绞痛相关的信号通路包括低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)、IL-17、细胞因子及其受体的相互作用、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、辅助性T细胞17(T helpercell 17,Th17)细胞分化等信号通路,这些信号通路均被验证与心绞痛的发病相关。有研究指出HIF-1α在心脏保护的调节中发挥着重要作用[26],该基因有助于组织重塑[27]。NF-κB通路可以通过调节炎症和细胞存活发挥关键作用[28],在不稳定型心绞痛患者的外周单核细胞中可被选择性激活,两复方治疗心绞痛可能通过抑制该信号通路从而抑制炎症反应,可能是治疗心绞痛的潜在机制。

综上所述,本研究通过网络药理学的方法初步阐明枳实薤白桂枝汤和人参汤“皆主胸痹”的作用机制,揭示了中医药多成分、多靶点、多途径的治疗优势,为后续两复方的分子机制研究提供了新线索,也为中医药“异病同治”研究提供了新思路。

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