玉米须多糖对糖尿病大鼠的糖脂代谢及PGC-1α蛋白糖异生信号通路的影响

胡玉立 丁雷 李梅 刘玮 赵丹 吴丽丽 秦灵灵 刘铜华

玉米须是禾本科植物玉蜀黍(ZeamaysL.)的干燥花柱，全国大部分地区均产，含有丰富的多糖、生物碱和黄酮类化合物等，现代药理学研究证明，玉米须具有降糖、降脂、抗氧化、调节免疫等作用[1-2]。同时玉米须，味甘淡，性平，能够利尿祛热、护肝利胆，契合消渴病内热的基本病机[3]。已有多项研究证明玉米须具有确切的降糖作用，其可能通过改善胰岛素抵抗，促进胰岛素分泌，促进糖原合成，抑制氧化应激等方面发挥作用[4-8]，但其是否抑制糖异生及其具体机制尚未阐明。本实验旨在观察玉米须多糖对2型糖尿病肥胖大鼠(Zucker diabetic fatty rats,ZDF)的糖脂代谢的影响，以及基于过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α) 蛋白信号通路探讨玉米须多糖抑制糖异生作用机制，为进一步深入研究玉米须的功效及降糖机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性ZDF大鼠12只，13～14周龄，270～400 g；正常对照ZL大鼠6 只，13～14周龄，280～330 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SYXK(Jing) 2016 0011。动物饲养于北京中医药大学SPF级动物实验室，室温(25±2)℃，相对湿度(50±5)%，昼夜循环12小时/12小时条件下。动物自由饮水，正常维持饲料喂养，饲料由北京中医药大学动物实验室提供。动物实验经北京中医药大学动物伦理委员会批准(编号:BUCM-4-2019040904-2104)

1.2 实验药物及试剂

玉米须多糖，购自西安品诚生物科技有限公司，批号：PC-1905043。

甘油三酯测定试剂盒(中生北控股份有限公司，执行标准号：YZB/国2087-2003);总胆固醇测定试剂盒(中生北控股份有限公司，执行标准号：YZB/国0689-2010)；低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(中生北控股份有限公司，执行标准号：YZB/国0599-2003)；高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(中生北控股份有限公司,执行标准号：YZB/国0677-2003)；糖原过碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain,PAS)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：G1281);苏木素—伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：G1120);叉头转录因子(forehead box-containing protein of the O subfamily 1，FoxO1)(C29H4)Rabbit mAb(CST公司，批号：2880)，Phospho-FoxO1(Ser256) Antibody(CST公司，批号：9461)；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)(D12F5) Rabbit mAb (CST 公司，批号：12940)；葡萄糖6磷酸酶 (glucose-6-phosphatase, G6Pase) (D5D2) Rabbit mAb(CST 公司，批号：12263)；Anti-PGC1 alpha antibody(Abcam 公司，批号：GR3213300-2)；β-Actin(13E5)Rabbit mAb(CST公司，批号：4970)；山羊抗兔IgG H&L(HRP)(Abcam公司，批号：GR3355126-1)。

1.3 实验仪器

台式高速冷冻离心机(德国SIGMA公司，3K15)；快速血糖仪及配套试纸(日本爱科来国际贸易上海有限公司，GT-1941)；光学显微镜(日本OLYMPUS公司，BX53)；垂直电泳仪(美国BIO-RAD公司，Mini-PROTEAN Tera System)；凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司，ChemiDocTM XRE with Image LabTM Software)。

1.4 动物造模、分组及给药

大鼠适应性喂养1周后，禁食不禁水12小时，采尾静脉血测定各组大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose， FBG)，以FBG>7.0 mmol/L且随机血糖>11.1 mmol/L作为2型糖尿病模型成模标准。根据ZDF大鼠FBG和体质量(body weight，BW)水平，采用区组随机法，实验动物分为正常对照组、模型组及玉米须多糖组，每组6只。玉米须多糖组给药剂量为500 mg/(kg·d)，正常组和模型组大鼠灌服去离子水，所有大鼠灌药体积均为1 mL/100 g体重，灌胃1次/天，连续给药5周，固定同一时间。给药期间，所有大鼠自由饮水及进食正常饲料。

1.5 血液样品的制备与指标检测

给药后每隔一周测量一次BW及尾静脉采血测定FBG。第5周禁食不禁水12小时，测大鼠空腹血糖作为0分钟血糖，按2 g/kg给大鼠灌胃50%葡萄糖溶液进行口服葡萄糖耐量实验(oral glucose tolerance，OGTT)，测定30 分钟、60 分钟、120 分钟血糖，计算曲线下面积[公式：AUC = 0.5×(Bg 0 min +Bg 30 min)/2 + 0.5×(Bg 30 min+Bg 60 min)/2 + 1×(Bg 60 min + Bg 120 min)/2]。

给药5周后，禁食不禁水12小时，1%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉，腹主动脉取血，3000 rpm、 4℃离心15分钟，取上清，检测总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)含量。快速收集肝脏组织，部分液氮冷冻，用于蛋白含量测定；部分4%多聚甲醛固定，用于肝脏形态学观察。

1.6 肝脏组织形态学观察

新鲜肝脏组织4%多聚甲醛固定24小时后，石蜡包埋，3～5 μm切片，根据HE和PAS染色试剂盒使用说明书步骤进行，常规光学显微镜高倍镜镜检，观察肝脏组织形态及糖原分布，并拍照保存图片。

1.7 蛋白免疫印迹法(Western blot，WB)检测糖异生相关蛋白PGC-1α、FoxO1及其磷酸化形式、PEPCK、G6Pase的表达

取冻存的肝脏组织黄豆粒大小，按照活性蛋白提取试剂盒提取肝脏总蛋白，考马斯亮蓝法定量，100℃沸水煮5分钟变性。制10%胶，上样量15 μg，电泳：80V，30分钟，100V 1小时，转膜：100V 1小时，摇床常温封闭1小时，加入配置好的一抗4℃过夜孵育，TBST漂洗三次，二抗常温孵育1小时，TBST漂洗三次，加ECL 超敏发光液反应1分钟，BIO-RAD凝胶成像仪显影，Image J 6.0分析灰度值，蛋白表达水平用目的蛋白与内参蛋白灰度比值来表示。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 玉米须多糖对ZDF大鼠一般情况的影响

正常组大鼠精神良好，活动自如，皮毛光泽。与正常组相比，模型组大鼠出现精神萎靡、活动度减低，伴多饮、多食、多尿等现象，皮毛光泽度低。与模型组比较，玉米须多糖组有类似表现，但多饮、多食、多尿程度较低，皮毛光泽度偏高。

2.2 玉米须多糖对ZDF大鼠体质量的影响

与正常组相比，模型组大鼠体质量显著偏高(P<0.05)；给药后，与模型组相比，玉米须多糖组体质量有下降趋势，但无统计学差异(P>0.05)，具体见表1。

表1 玉米须多糖对ZDF大鼠体质量的影响

2.3 玉米须多糖对ZDF大鼠空腹血糖的影响

第0周，与正常组相比，模型组大鼠的血糖具有差异(P<0.05)，模型组和给药组无差异(P>0.05)；从第4周开始至用药结束，玉米须多糖组与模型组血糖出现显著差异(P<0.05)，具体见表2。

表2 玉米须多糖对ZDF大鼠空腹血糖的影响

2.4 玉米须多糖对ZDF大鼠糖耐量的影响

与正常组相比，模型组大鼠的血糖的0分钟、30分钟、60分钟、120分钟的血糖及AUC均显著升高(P<0.05)；与模型组相比，玉米须多糖组0分钟、30分钟、60分钟血糖及AUC均显著下降(P<0.05)，具体见表3。

表3 玉米须多糖对ZDF大鼠糖耐量的影响

2.5 玉米须多糖对ZDF大鼠血脂的影响

与正常组相比，模型组的TC、TG、LDL-C、HDL-C水平明显升高(P<0.05)；给药5周后，与模型组相比，玉米须多糖组LDL-C显著下降(P<0.05)，TC、TG有下降趋势，HDL-C有上升趋势，但均无统计学差异(P>0.05)，具体见表4。

表4 玉米须多糖对ZDF大鼠血脂的影响

2.6 各组ZDF大鼠肝脏组织病理学观察

2.6.1 HE 正常组肝细胞大小、形态均匀正常，肝小叶结构清晰，以中央静脉为中心，向四周呈索状排列，内未见脂质沉积；模型组肝小叶肝索结构消失，肝细胞肿大变性，存在大量脂肪空泡及脂质沉积。与模型组相比，玉米须多糖组肝小叶呈索状排列，结构清晰，肝细胞形态大致正常，存在轻度脂肪病变，但无明显大脂滴形成(见图1)。

注：A：正常组B：模型组C：玉米须多糖组。

2.6.2 PAS 正常组肝脏PAS染色明显饱满，均匀，呈紫色；与正常组比较，模型组肝脏见大量脂肪空泡，细胞间、细胞内PAS染色明显稀薄，不均匀；与模型组比较，玉米须多糖组大鼠肝组织糖原含量明显增多，脂肪空泡明显减少，围绕肝小叶均匀分布(见图2)。

注：A：正常组B：模型组C：玉米须多糖组。

2.7 各组大鼠肝脏组织糖异生通路PGC-1α、FoxO1、PEPCK、G6Pase蛋白表达的比较

如图3、表5所示，与正常组比较，模型组大鼠肝脏组织PGC-1α、PEPCK、G6Pase蛋白表达量升高(P<0.05), FoxO1蛋白表达量升高但无统计学差异(P>0.05);pFoxO1/FoxO1比值显著降低(P<0.05)；与模型组比较，玉米须多糖组大鼠肝脏组织PGC-1α、PEPCK、G6Pase蛋白表达量降低(P<0.05)，FoxO1蛋白表达量减少但无统计学差异(P>0.05)，pFoxO1/FoxO1比值显著升高(P<0.05)。

表5 玉米须多糖对ZDF大鼠肝组织糖异生通路PGC-1α相关靶蛋白的影响

注：A：正常组B：模型组C：玉米须多糖组。

3 讨论

近年来，2型糖尿病由于其高发病率、高致残率逐渐成为威胁人类健康的主要慢性病之一，造成严重的社会经济负担[9-10]，探索天然有效的降糖药成为研究热点。玉米须作为传统药食两用的中药，大量实验表明其能够有效降低糖尿病大鼠血糖。本研究结果显示，玉米须多糖干预5周后可显著降低ZDF大鼠的FBG、OGTT-AUC、LDL-C，对TC、TG具有降低趋势，HDL-C有升高趋势，说明玉米须多糖可以降低血糖，改善糖耐量，促进肝糖原合成及调节糖异生。

肝脏作为控制身体能量代谢的关键器官，对维持葡萄糖稳态至关重要，约有90%内源葡萄糖由肝脏合成，肝脏糖异生决定空腹血糖水平，在调节血糖中起关键作用[11]。正常情况下，进食后胰腺β细胞释放胰岛素以抑制肝脏中糖异生和糖原分解， 从而降低血糖水平； 空腹时， 胰腺α细胞释放胰高血糖素，增加肝糖异生，升高血糖。肝脏糖异生活跃，内源性葡萄糖输出增多，亦是肝脏胰岛素抵抗的主要表现，同时也是促进糖尿病发生发展的重要因素。 因此， 糖异生也是目前临床治疗2型糖尿病的主要靶点。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)是一种多功能调节因子，通过调节转录因子活性，调控生物过程如线粒体生物发生和呼吸、糖异生和葡萄糖转运、糖原分解、氧化磷酸化等[12]。PGC-1α禁食后在肝脏中被诱导，在一些糖尿病或胰岛素信号缺乏的模型中升高[13]，尤其在糖异生增高的几种糖尿病模型中上调[14]。PGC-1α可通过PGC-1α/雌激素受体相关受体α(estrogenreceptor-relatedreceptorα,ERRα)负反馈、肝细胞核因子4α(hepatic nuclear factor 4 alpha,HNF4α)的共激活等多条通路调节糖异生过程[12]。近年来，PGC-1α作为糖尿病治疗的一个新靶点而逐渐被关注。糖异生主要由PEPCK和G6Pase调节，它们是将丙酮酸转化为葡萄糖的关键酶，其基因表达水平受多种转录因子的调控，如FoxO1、PGC-1α、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)等[15]。胰高血糖素通过转录激活因子CREB-CRTC2和FoxO1-PGC-1α复合物上调糖异生基因G6Pase和PEPCK的表达，以维持空腹血糖水平。研究证实，胰岛素-AKT途径可以通过FoxO1的磷酸化分离PGC-1α-FoxO1复合物[13]。FoxO1被证明也可直接与葡萄糖生成基因的启动子结合，并激活葡萄糖产生[13]。肝细胞特异性缺失FoxO1可降低禁食小鼠糖原分解和糖异生，导致低血糖[16]。本实验结果显示，通过玉米须多糖治疗后，糖尿病大鼠的PGC-1α、PEPCK、G6Pase水平均明显下降，pFoxO1/FoxO1水平明显上升，说明玉米须可能通过促进FoxO1磷酸化表达，阻止FoxO1与PGC-1α结合，减少PEPCK及G6Pase的表达，从而抑制大鼠的肝脏糖异生过程，达到降低血糖的目的。

本实验采用瘦素受体敲除的自发型ZDF大鼠，其进食量明显增加，同时存在代谢综合征的表现，是研究糖尿病的良好动物模型[17]。给药5周后，糖尿病大鼠的血糖、OGTT AUC以及LDL-C显著降低，肝脏的脂肪沉积及糖原分布亦有了明显改善，实验机制表明其可能通过促进FoxO1的磷酸化表达，抑制PGC-1α对糖异生的调节作用，从而降低血糖，但玉米须对糖异生过程中其他转录因子是否有影响，及其可能的上游通路，有待进一步探索。