醒脑静注射液对大鼠脑出血模型血脑屏障通透性及相关蛋白的影响

王丽琴 孙逸坤 王晓峰 李媛媛 宋珂 刘浩琦 常静玲 高永红

《全球疾病，伤害和危险因素负担研究》表明2016年全球有8000万中风病例，死亡550万[1]。在我国，脑卒中患者中脑出血占28.2%[2]。血脑屏障是位于脑组织与外周血液循环之间的复杂细胞结构，在维持内环境稳态方面起到重要作用[3]。血脑屏障破坏是出血性中风的突出病理特征[4]。脑出血后会导致血脑屏障通透性增加以及功能障碍，其功能障碍引起的原发性损伤可能会破坏紧密连接及内皮细胞等的结构，导致潜在的神经毒性和血管活性化合物进入大脑，最终导致神经元细胞死亡[5-6]。

研究发现，醒脑静注射液在治疗急性脑出血方面具有降压，维持水和电解质平衡，缓解炎症反应，神经保护等作用[7-8]。本研究采用胶原酶诱导的脑出血大鼠模型，结合病理、分子生物学等方法观察大鼠脑出血脑组织超微结构的改变及相应的病理变化，观察并检测脑出血后脑组织中血脑屏障的结构变化及相关蛋白的表达，探讨醒脑静注射液减轻脑出血后继发性损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验中所用无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级健康雄性SD大鼠27只，体质量(270±20) g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。SD大鼠饲养于东直门医院实验动物中心，许可证号：SYXK(京)2015-0001，大鼠分笼饲养并给予充分食水。

1.2 主要试剂与仪器

醒脑静注射液(10 mL/支)：无锡济民可信山河药业股份有限公司(货号151107)；胶原酶VII：Sigma公司(货号C0773)；伊文思蓝(Evens blue, EB)：Solarbio公司; 二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒、预染蛋白分子量marker、山羊抗兔免疫球蛋白G辣根过氧化物酶Goat anti-Rabbit IgG(immunoglobulin G，IgG)(H+L)HRP(horseradish peroxidase，HRP)、山羊抗小鼠免疫球蛋白G辣根过氧化物酶 Goat anti-mouse IgG(H+L)HRP：PPLYGEN公司。水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)、闭合蛋白(Occludin)一抗：Abcam公司；紧密连接蛋白(tight junction protein,ZO-1)一抗：Invitrogen公司；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)一抗：Proteintech公司。

数字脑立体定向仪：美国AST公司；微量注射泵：美国HARVARD公司；微量注射器：美国Hamilton公司；光学显微镜：日本Olympus公司；透射电子显微镜：日本Hitachi公司；电泳仪：北京百晶生物技术有限公司；凝胶成像系统：美国UVP公司；十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰(SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)电泳系统、ChemiDoc MP化学发光成像系统：美国Bio-Rad公司；自动脱水、包埋机、石蜡组织切片机：德国Leica公司。

1.3 实验动物造模、分组及给药

参考文献[9]所述方法，随机选取9只SD大鼠为假手术组，其余18只大鼠采用VII型胶原酶注射入尾状核的方法来制备大鼠脑出血模型。大鼠术前禁食不禁水过夜，称重麻醉后剃去颅顶毛发，固定于立体定向仪并调整至前后囟在同一水平面上，于颅顶正中行切口，充分暴露头骨，以前囟为原点，右侧旁开3.0 mm，向前0.5 mm(尾状核定位点)行颅骨钻孔。于微量注射器中吸取1 μL(0.1 u/μL)VII型胶原酶，将微量注射器固定于立体定位仪上，于钻孔处缓慢进针，其深度为5.5 mm，注射速度为200 nL/分钟，5分钟完成注射，留针10分钟后将针退出并使用骨蜡封闭颅骨钻孔并缝合、消毒。假手术组只行钻孔及进针。术后2小时动物清醒后采用改良的神经系统严重程度(modified neurologic severity scores，mNSS)评分标准[10]进行神经功能评分，评分为7～12分的大鼠视为模型建立成功。本实验中造模大鼠及假手术组大鼠均未出现死亡。

将造模成功的SD大鼠纳入实验，随机分为醒脑静组和模型组，每组9只。醒脑静组行腹腔注射醒脑静注射液0.18 mL/100 g，假手术组和模型组腹腔注射等量生理盐水。每隔24小时给药一次，连续给药3天。

1.4 EB检测血脑屏障通透性

给药3天后，将假手术组、模型组、醒脑静组大鼠(每组1只)麻醉后剪开腹股沟部位皮肤，暴露股动脉，注射2%的EB染液(2 mL/kg)，经血液循环2小时后可见大鼠全身皮肤及黏膜转为蓝色。将大鼠固定于鼠板，开胸使其心脏暴露，经左心室插入灌流针直至主动脉弓，使用止血钳固定灌流针，剪开右心耳，夹闭腹主动脉，灌注无菌生理盐水约200 mL，至肝脏和肺脏转为白色，然后灌注4%多聚甲醛直至脑组织固定，取出脑组织浸泡于4%多聚甲醛中，48小时后切片拍照。

1.5 透射电镜观察星形胶质细胞足突水肿

每组选取3只大鼠按上述灌流方法灌流后开颅取脑，于出血灶周围取1 mm3大小的组织块放入2.5%戊二醛电镜固定液中固定2小时，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)漂洗3次，二甲砷酸钠缓冲液冲洗后包埋，超薄切片机切片，经铀染、铅染后，使用透射电镜观察各组脑组织中星形胶质细胞胞体和周边结构变化及血管周围水肿情况。采用Image pro plus 6.0软件分析星形细胞足突水肿面积，每只大鼠脑组织切片随机选取15个视野取均值计算。

1.6 免疫组化检测AQP4的表达

大鼠灌流取脑后，将脑组织进行石蜡包埋切片。常规脱蜡至水化，间接水浴锅加热修复法进行抗原修复，使用0.3% Triton孵育10分钟后PBS冲洗，10%山羊血清37℃孵育30分钟，加入AQP4一抗后于4℃冰箱过夜，复温30分钟，PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，使用中性树胶封片，显微镜下观察。

1.7 蛋白免疫印迹法检测血脑屏障相关蛋白的表达

每组选取5只大鼠麻醉后断头取脑，取血肿周边2 mm3脑组织置于冻存管中，于液氮中保存备用。加入裂解液及蛋白磷酸酶抑制剂，超声匀浆提取各组大鼠脑组织蛋白，离心15分钟(4℃，12000 rpm)，取上清后使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度并定量为同一浓度，煮沸20分钟后备用。煮好的样品进行SDS-PAGE电泳，转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，分别利用相应的抗体(β-actin、AQP4、VEGF、Occludin、ZO-1)进行孵育并于4℃环境过夜，Tris缓冲盐吐温(Tris Buffered saline Tween，TBST)漂洗，加入二抗孵育1小时，TBST洗膜3次，将PVDF膜浸泡于电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)显色液中1分钟，暗室中曝光、显影，使用Image J软件分析条带灰度值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 醒脑静对脑出血大鼠脑组织血脑屏障的通透性的影响

假手术组大鼠脑切片皮质及白质均未见EB染色，表明无血脑屏障的渗漏。而模型组、醒脑静组在出血灶周边可见不同程度的蓝染，血脑屏障的EB渗透量均有不同程度改变。醒脑静组出血灶周边蓝染程度与模型组相比较轻，血脑屏障的渗漏程度少于模型组。见图1。

图1 醒脑静注射液对大鼠血脑屏障渗漏程度的影响(EB染色)

2.2 醒脑静对脑出血大鼠脑水肿的影响

2.2.1 醒脑静改善脑出血大鼠脑组织星形胶质细胞足突水肿 为了进一步明确醒脑静改善脑水肿保护血脑屏障的机制，采用透射电镜观察并分析星形胶质细胞足突水肿面积。结果显示，假手术组血管基膜连续，形态规则且表面光滑，内皮胞质厚度均一，血管周围电子密度分布均匀；脑出血后3天，模型组组织稀疏，内皮细胞结构不规则，局部膨出，部分与基膜剥离，血管周围星形胶质细胞足突水肿明显，血脑屏障结构破坏，通透性增加。醒脑静组血管周围有局部水肿，而其水肿面积明显低于模型组，损伤程度明显减轻(P<0.05)。见图2、表1。

表1 各组大鼠脑组织星形胶质细胞足突水肿程度比较

注：A.假手术组；B.模型组；C.醒脑静组。

2.2.2 醒脑静降低脑出血大鼠脑组织AQP4和VEGF蛋白表达 免疫组化结果显示，模型组AQP4蛋白表达量高于假手术组，醒脑静组AQP4蛋白表达量则低于模型组。Western blot的结果显示，模型组AQP4和VEGF蛋白表达较假手术组明显增高(P<0.05)；醒脑静组表达量相比模型组明显下降(P<0.05)。见图3～4、表2。

注：A.假手术组；B.模型组；C.醒脑静组。

图4 Western blot检测脑出血大鼠脑组织中AQP4、VEGF的表达

表2 各组大鼠脑组织中AQP4、VEGF的蛋白表达比较

2.3 醒脑静对脑出血大鼠脑组织中Occludin、ZO-1蛋白表达的影响

Western blot的结果显示，模型组大鼠脑组织中Occludin、ZO-1蛋白表达低于假手术组(P<0.05)，醒脑静组Occludin、ZO-1蛋白表达较模型组增加(P<0.05)。见图5、表3。

表3 各组大鼠脑组织中Occludin、ZO-1的蛋白表达比较

图5 Western blot检测脑出血大鼠脑组织中Occludin、ZO-1的表达

3 讨论

中医理论中脑出血属于中风范畴，其基本病机为气血逆乱致血溢脑脉之外。脏腑功能失调，内生风邪、火邪，灼脉络，迫血行，血溢脉外而发为脑出血[11-12]。络脉作为经络系统的分支，对于维持人体正常的生命活动具有十分重要的意义[13]。脑络是络脉的一部分，相当于大脑中的“微循环”，是脑中气血津液交换的场所[14]。脑络灌注气血津液充实脑髓，散布阳气以温煦脑神，是神机运动的物质基础和源动力[15]。血脑屏障由颅内毛细血管内皮细胞及其紧密连接、星形胶质细胞、周细胞和基质构成，可维持离子平衡、营养物质转运，阻止有害物质进入脑组织[16]。脑出血后，由血红蛋白裂解释放的有毒物质以及氧化应激和炎性浸润等病理变化直接破坏血脑屏障、紧密连接，改变相关蛋白的表达，导致血脑屏障通透性增加，致使血脑屏障功能障碍，从而导致血管性水肿，水通道蛋白表达增加，最终导致神经元细胞死亡[4,17-18]。从结构特点和功能上，血脑屏障和脑络具有一定的相似性。

醒脑静具有醒脑开窍通络的作用，其主要成分包括栀子、冰片、郁金、麝香。其中麝香气味芳香，善于走窜，散瘀通络，能通诸窍不利，开经络之壅滞；冰片专于泻火毒,辛香走窜，助麝香通诸窍，二者协同发挥开窍醒脑的作用；郁金性苦寒，化痰开郁，协同麝香、冰片二药开窍通络；栀子性味苦寒，清理三焦之火，解痰瘀所化生之毒邪。上述诸药共同起到化痰通络、凉血解毒之功[19-20]。常见的脑出血模型建立为胶原酶诱导模型和自体血模型两种方法[21]。其中胶原酶诱导的脑出血模型中血肿的形成与人脑内血管破裂所引起的脑出血情况相似，可以较好地模拟患者脑出血急性期脑内血肿扩大的病理过程，尤其适用于研究脑出血继发性损伤的机制和药物对神经功能影响的作用机制[22]。因此，本研究选用该模型探讨醒脑静注射液对脑出血后继发性脑损伤的治疗效果与机制，结果表明醒脑静能够降低EB的通透性，改善血脑屏障功能。

星形胶质细胞上表达的AQP4、钾离子通道可以稳定脑内水和离子的平衡，其衍生因子VEGF可通过调节紧密连接影响血脑屏障完整性和通透性，引起内皮细胞凋亡，破坏血脑屏障[23-24]。AQP4参与维持血脑屏障通透性完整性和发育过程[3]。VEGF在脑组织持续或严重缺氧时其表达量急剧升高可以加重脑损伤。研究表明脑出血后AQP4、VEGF表达均显著增加，通过抑制二者的表达可有效减轻脑水肿及神经功能损伤[25-26]。本实验发现脑出血后3天模型组星形细胞足突水肿严重，模型组大鼠AQP4、VEGF表达量明显高于假手术组；醒脑静组足突水肿程度、AQP4和VEGF的蛋白表达量明显低于模型组，表明醒脑静能够调节AQP4、VEGF的表达，具有减轻脑水肿、保护神经功能的损伤的作用。

紧密连接是维持血脑屏障结构和功能完整性的结构基础[27]。Occludin被认为是血脑屏障中一种重要的紧密连接构建蛋白，有助于细胞生长和分化，改变细胞间的通透性。ZO-1在保持血脑屏障完整性方面起着重要作用[28]。当ZO-1功能和结构发生变化后，紧密连接遭到破坏，从而导致细胞间缝隙增加，进而血管通透性增加，随后发生血管源性水肿[27,29]。研究发现脑出血后血肿周边的血管内皮细胞的紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达均下降，这可能导致血脑屏障紧密连接的破坏[30]，通过增加紧密连接蛋白Occludin、ZO-1的表达可减轻缺血性脑卒中大鼠脑水肿[31]。本研究中，脑出血模型组大鼠脑组织Occludin和ZO-1的表达量均显著低于假手术组，表明模型组大鼠血脑屏障发生严重破坏。而醒脑静组大鼠脑组织中Occludin和ZO-1的表达量均明显高于模型组，表明醒脑静能够调节这两种紧密连接蛋白的表达，从而保护血脑屏障的完整性。

综上所述，本研究建立大鼠脑出血模型，观察脑出血大鼠脑组织血脑屏障的结构及功能变化，发现醒脑静注射液可明显降低大鼠脑出血脑组织中AQP4、VEGF的表达，上调紧密连接蛋白Occludin、ZO-1，降低血脑屏障的通透性，减轻脑水肿。