Lactobacillus brevis D-tag1产L-阿拉伯糖异构酶的条件优化

王 晓 茹，杜 梦 鸽，胡 木 子，姜 珊，张 春 枝

(大连工业大学 生物工程学院,辽宁 大连 116034)

0 引 言

L-阿拉伯糖异构酶(L-AI，EC 5.3.1.4)是一种胞内酶，它能催化L-阿拉伯糖生成L-核酮糖，由于D-半乳糖和L-阿拉伯糖在结构上具有相似性，因此该酶也可以将D-半乳糖催化为D-塔格糖[1]。

D-塔格糖是一种存在于自然界，但含量极少的低热量糖，可广泛应用于食品和医药领域。D-塔格糖甜度为蔗糖的92%，热量为蔗糖的1/3[2]。从甜度、口感及其他方面综合评价，它是有可能替代蔗糖的低能量糖。2001年，美国食品和药物管理局(FDA)确定D-塔格糖为普遍公认安全食品(GRAS)[3]。2014年，根据《中华人民共和国食品安全法》和《新食品原料安全性审查管理办法》有关规定，塔格糖被批准为新食品原料。D-塔格糖的生产方法有化学合成法和生物转化法[4]，但化学法副产物较多，纯化困难，环境不友好。生物法转化效率高、专一性强、副产物少、纯化步骤简单，是生产D-塔格糖的主要研究方向[5]。L-阿拉伯糖异构酶转化D-半乳糖生产D-塔格糖，是一种简便、高效、环保的方法，采用食品安全菌株生产D-塔格糖尤为重要。实验室先前筛选获得了一株产L-AI的乳酸菌，鉴定为短乳杆菌。本研究优化了该菌株的培养条件和产酶条件，以期提高菌株产酶能力。

1 材料与方法

1.1 材 料

短乳杆菌L.brevisD-tag1(MF 465792)，实验室分离保藏。

固体培养基(%)：L-阿拉伯糖2.0，酵母浸粉0.5，牛肉膏1.0，蛋白胨1.0，乙酸钠0.5，柠檬酸二铵0.2，K2HPO40.2，MgSO40.058；吐温80 0.1 mL，pH 6.0～6.2，琼脂粉2.0。121 ℃湿热灭菌20 min。

种子培养基(%)：L-阿拉伯糖2.0，酵母浸粉0.5，牛肉膏1.0，蛋白胨1.0，乙酸钠0.5，柠檬酸二铵0.2，K2HPO40.2，MgSO40.058，吐温80 0.1 mL，pH 6.0～6.2，加入灭菌CaCO31.0。121 ℃湿热灭菌20 min。

发酵基础培养基(%)：L-阿拉伯糖0.5，乙酸钠1.0，磷酸三钾0.02，蛋白胨1.0，酵母浸粉1.0，MgSO40.05，pH 6.0～6.2。121 ℃湿热灭菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 D-塔格糖质量浓度的测定

采用间苯二酚显色法测定D-塔格糖的含量[6]。取7支试管，标准品D-塔格糖终质量浓度分别为0、10、20、30、40、50、60 μg/mL，每个试管中分别加入等量间苯二酚显色剂，振荡混匀，沸水浴20 min，迅速冷却至室温。以1号管作空白，400 nm测定吸光度。以D-塔格糖质量浓度为横坐标，不同质量浓度下对应显色样品的吸光度为纵坐标，绘制D-塔格糖浓度的标准曲线。

1.2.2 L-AI酶活力测定

取100 mL发酵液，4 ℃，8 000 r/min，离心10 min，弃去上清，菌体沉淀用pH 6.0～7.0的磷酸盐缓冲液洗涤两遍，离心，菌体沉淀用于酶活力测定。

酶活力测定：菌体用1 mL 0.5 mol/L D-半乳糖悬浮，置于60 ℃恒温水浴中振荡反应48 h，8 000 r/min离心10 min，取上清。适当稀释后取2 mL与等量间苯二酚显色剂混合，在400 nm测定吸光度。在相同条件下，以稀释相同倍数的0.5 mol/L D-半乳糖作为空白对照。

L-AI酶活定义：以D-半乳糖为底物，每毫升发酵液每分钟发酵生成1 μg D-塔格糖所需的酶量为一个酶活力单位，以U/mL表示。酶活力取3次平行实验的平均值。

1.2.3 种子液的制备

挑取37 ℃培养2 d的平板上单菌落，接种于装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，于37 ℃、180 r/min下振荡培养12 h。

1.2.4 产酶发酵条件

将3%的种子液接种于装有100 mL发酵液的250 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min振荡培养24 h。

1.2.5 单因素试验优化产酶条件

发酵基础培养基中，改变L-阿拉伯糖的添加量，其余条件不变来优化碳源；改变氮源及其添加量，其余条件不变来优化氮源；改变初始pH，其余条件不变优化发酵初始pH。发酵温度和时间的优化采用优化后的发酵基础培养基。

1.2.6 全细胞转化D-半乳糖制备D-塔格糖

根据全细胞转化条件优化的实验结果，9.0%的D-半乳糖10 mL，加入适量L.brevisD-tag1湿菌体，pH 7.0、55 ℃反应48 h，测定D-塔格糖的生成量。

2 结果与讨论

2.1 碳源的优化

L-AI是短乳杆菌L.brevisD-tag1在培养基中含有诱导物时方可产生的诱导酶，因此实验选用L-阿拉伯糖作碳源，仅对其添加量进行优化。在L-阿拉伯糖质量分数0.5%～2.0%进行发酵试验，如图1所示。结果表明，当L-阿拉伯糖使用量为0.5%时，菌体生成量和酶活力均达到最大，酶活力为3.0 U/mL。

2.2 氮源的优化

发酵基础培养基中的氮源分别换成质量分数1.0%的牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、硫酸铵和尿素进行实验，结果如图2所示。从图2可以看出，牛肉膏、蛋白胨和玉米浆明显优于硫酸铵和尿素，有机氮源更加适合菌体生长和产酶。玉米浆优于牛肉膏和蛋白胨，这可能是因为玉米浆中的生物素、维生素等微量营养成分，更适合L.brevisD-tag1的生长和产酶。

图2 氮源对菌体生长和产酶的影响Fig.2 Effect of nitrogen sources in cell growth and enzyme production

对玉米浆添加量进行了优化，如图3所示。在玉米浆添加量1%～5%，菌体生长量随着玉米浆用量的增加而增大，但产酶量却在玉米浆用量2%时达到最大，此后不再增大。分别收集玉米浆使用量为2%和4%的菌体细胞，破壁后测定酶活力，结果后者大于前者，说明酶活力不随菌体量增加而增大的原因可能是高浓度玉米浆中生物素含量较高，细胞膜致密，通透性差，不利于底物和产物的进出。

图3 玉米浆添加量对菌体生长和产酶的影响Fig.3 Effect of corn steep liquor content on cell growth and enzyme production

2.3 发酵温度的优化

在15～60 ℃测定L.brevisD-tag1的生长和产酶情况，如图4所示。37 ℃时菌株生长和产酶均达到最大。但该菌株耐热性较差，当发酵温度接近50 ℃时，该菌株几乎不生长和产酶。

图4 发酵温度对菌体生长和产酶的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on cell growth and enzyme production

2.4 发酵初始pH的优化

在初始pH 3～10测定L.brevisD-tag1的生长和产酶情况，如图5所示。菌株在pH 6时生长和产酶均达到最大。pH低于5或高于7，生长和产酶量急剧下降。

图5 发酵pH对菌体生长和产酶的影响Fig.5 Effect of fermentation pH on cell growth and enzyme production

2.5 L.brevis D-tag1产L-AI过程曲线

L.brevisD-tag1采用优化后条件发酵60 h，测定不同时间的菌体量、酶活力和pH，如图6所示。从图6中可以看出，24 h菌体量和酶活力均达到最大，酶活力为6.8 U/mL，此后保持不变。发酵过程中pH呈下降趋势，可能是发酵产酸所致。L-AI活力在24 h达到最大，随后逐渐降低。主要原因不是L-AI迅速失活，而是长时间培养细胞膜致密，通透性降低所致。图中还可看出，发酵初期(6 h)菌株即可产生L-AI，初步确定短乳杆菌L.brevisD-tag1产L-AI为同步合成型。

图6 L.brevis D-tag1产L-AI过程曲线Fig.6 Time-course of L-AI production by Lactobacillus brevis D-tag1

2.6 L.brevis D-tag1催化D-半乳糖生成D-塔格糖

发酵液4 L，离心收获菌体细胞，催化900 mg D-半乳糖异构化生成390～400 mg D-塔格糖，转化率为43%～44%。

目前报道的产L-AI的菌株有20多种[7-9]，但产酶活力不足以用于D-塔格糖的生产。为提高L-AI产量，也进行了大肠杆菌基因工程异源表达的研究[10]。本试验所用L.brevisD-tag1是乳酸菌家族成员，产L-AI最适反应温度为65 ℃，最适pH为7.0，75 ℃以下、pH 6.0～9.0酶活力稳定[11]。具有D-塔格糖生产潜力和良好的食品安全性。

3 结 论

采用单因素试验对实验室已筛选的L.brevisD-tag1发酵生产L-阿拉伯糖异构酶条件进行优化，在初始pH 6.0、发酵温度37 ℃、发酵时间24 h的最适条件下，优化后菌株产酶活力为6.8 U/mL，是优化前产酶能力的2.3倍。催化D-半乳糖生成D-塔格糖的转化率为43%～44%。L.brevisD-tag1产L-AI为同步合成型。