L-赖氨酸全营养流加发酵工艺的研究

王金多，李澜潇，徐庆阳

(天津科技大学 生物工程学院，天津 300450)

L-赖氨酸作为人和动物的八大必需氨基酸之一[1]，在医疗、畜牧业及食品工业得到了广泛的应用。在医疗方面，用于治疗由病毒引起的疱疹，有提高机体抵抗病毒的能力，L-赖氨酸和谷氨酸的复合盐可用于脑部组织的保护[2]，并且对减少骨密度降低和钙流失有效果。L-赖氨酸最主要的应用范围是畜牧业，作为饲料添加剂，有助于提高禽畜的抗病性和生长速率，需求量巨大[3-5]。近些年来，各大企业争相开展L-赖氨酸的生产。在食品工业中，L-赖氨酸作为营养补充剂，广泛应用于谷物制品中，亦可作为调味品添加到食品中。由于L-赖氨酸的主要生产方式是发酵，如何有效地提高产量、提高葡萄糖-氨基酸转化率、降低设备损耗、优化分离提纯工艺成为降低成本的关键[6]。

L-赖氨酸的发酵优化方法有溶氧、在线控制pH和优化培养基配比等，上述方法对提高L-赖氨酸的产量、减少副产物的积累和提高糖酸转化率等有很好的作用[7-8]。为解决菌体生长后期菌体活力明显减弱、产酸能力下降等问题，实验通过全营养流加工艺，探究最适全营养流加浓度和最适流加时间[9-12]，达到长时间维持菌体稳定期和高产酸速率[13]、防止早衰的目的[14]。实验通过设置5个流加梯度，采用低速全程流加全营养的方法，并对比生物量、单位生长速率、L-赖氨酸产量和单位产酸速率等参数，确定最适宜的全营养流加浓度。根据已确定的最佳全营养流加浓度，采用流速为25 mL/h恒速分时流加全营养的方法，分析在菌体生长的不同阶段流加全营养对发酵生物量、生长速率、L-赖氨酸产量、单位产酸速率等的影响，最终应用于实际生产中，提高L-赖氨酸产量和糖酸转化率，降低后处理成本，在提高企业经济效益的基础上实现绿色生产[15]。

1 材料与方法

1.1 菌种

谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)LS260：由天津科技大学代谢工程实验室保藏。

1.2 培养基

种子罐培养基：葡萄糖80 g/L，豆饼水解液15 mL/L，玉米浆干粉20 g/L，(NH4)2SO4·7H2O 6 g/L，KH2PO41.7 g/L，MgSO40.6 g/L，VB11.5 mg/L，VB51.5 mg/L，VB121.5 mg/L，VH2 mg/L。

发酵培养基：葡萄糖60 g/L，豆饼水解液20 mL/L，玉米浆干粉25 g/L，(NH4)2SO4·7H2O 5 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO41 g/L，VB11 mg/L，VB51 mg/L，VB121 mg/L，VH1.5 mg/L。

全营养培养基：一定浓度的发酵培养基。

1.3 主要仪器

主要仪器设备见表1。

表1 仪器设备

1.4 培养方法

斜面培养：一代试管斜面活化2根，恒温箱32 ℃培养24 h，二代茄形瓶斜面活化2支，恒温箱32 ℃培养18 h。

种子罐培养：接种量2支茄形瓶，发酵体积2 L，培养温度34 ℃，pH 7.0～7.2，溶氧45%以上，转速与溶氧联动，种子培养12～15 h。

发酵罐培养：接种量600 mL，发酵体积3 L,培养温度34 ℃，pH 7.0～7.2，溶氧30%以上，转速与溶氧联动，发酵时间36 h。

1.5 实验方法

1.5.1 梯度浓度低速全程流加全营养策略

分别配制发酵培养基浓度100%、75%、50%、25%的流加料，从发酵起始开始流加，全程以20 mL/h低速流加，至发酵36 h结束。

1.5.2 恒速分时流加全营养策略

根据1.5.1确定的最适全营养浓度，在发酵过程和菌体生长的不同状态，分别选择5，10，15，20 h恒速流加全营养，流加速度为20 mL/h。

1.6 检测方法

1.6.1 pH值测定

采用梅特勒-托利多pH在线检测，精密pH试纸辅助检测。

1.6.2 菌体生物量测定

菌体生物量采用OD600吸光度法测定，发酵液用容量瓶稀释特定倍数后，用可见光分光光度计测定吸光度，吸光度×稀释倍数得到实际OD值，可以直接表示菌体生物量。

1.6.3 L-赖氨酸含量测定

发酵液中L-赖氨酸及副产物含量采用高效液相色谱法测定，采用Agilent C18色谱柱(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)，衍生剂为2,4-二硝基氟苯，柱前衍生，流动相为50%的乙腈、4.1 g/L的醋酸钠溶液，柱温33 ℃，流速1 mL/min，检测波长360 nm。

1.7 数据处理

糖酸转化率SA计算公式为：

式中：ρ为L-赖氨酸质量浓度，g/L；V为发酵液总体积，L；m为总耗糖量，g。

所有实验数据取3次实验的平均值。单因素方差分析之后采用Dunnett-t检验来确定数据差异的显著性。

2 结果与讨论

2.1 梯度浓度低速全程全营养流加策略

目前，在L-赖氨酸的发酵过程中，一般采用补料分批发酵，一次性投入底物培养基，过程中流加葡萄糖等碳源维持发酵。随着发酵的进行，菌体细胞不断翻倍，用以支持菌体生长的营养物质浓度逐渐降低，导致发酵中后期常出现菌体活力下降。而在合适的发酵阶段向培养体系中流加合适浓度的全营养则能有效解决上述问题，达到提高菌体活力，延缓菌体衰退，延长稳定期及产酸高峰期的效果。

值得注意的是，过高的营养浓度可能也会使菌体生长受到抑制。因此，为了确定合适的全营养培养基浓度，本实验设置100%、75%、50%、25%、0% 5个流加培养基浓度梯度，以0%为对照组，进行发酵优化对比实验[16]，探究不同全营养培养基浓度对L-赖氨酸发酵产酸的影响。过程中每隔2 h取样，检测生物量及L-赖氨酸产量，并计算菌体生长速率及糖酸转化率，结果见图1～图4。

图1 不同浓度恒速全程全营养流加对生物量的影响

图2 不同浓度恒速全程全营养流加对生长速率的影响

图3 不同浓度恒速全程全营养流加对产量的影响

图4 不同浓度恒速全程全营养流加对产酸速率的影响

由图1可知，流加浓度为0%，在发酵进行至20 h时，菌体生物量开始下降，菌体量从20 h开始明显下降，菌体衰亡相对流加全营养组提前；流加浓度为50%时，最大菌体量为123.9，较对照组提高了33.8%，且流加全营养的4组的最终OD值都比对照组高。

由图2可知，流加浓度为75%、50%、25%时都能有效地延缓菌体活力下降，并且在发酵前期能提高菌体的生长速率，流加浓度为50%时，6～8 h达到最大生长速率24.8%，较对照组提高了18.09%。

由图3可知，流加浓度为75%、50%、25%时，L-赖氨酸产量相较对照组分别提高了21.6%、40.7%、15.6%，并且在全营养流加浓度为50%时，产量达到235 g/L，产量最高；全营养流加浓度为100%时，因流加全营养导致菌体营养中毒，发酵液中营养成分过剩，导致胞内代谢流紊乱，产酸量低于对照组。

由图4可知，流加浓度为75%、50%、25%时，L-赖氨酸产酸速率较对照组明显提高，产酸速率分别提高了16.9%、30.8%、13.1%，但流加浓度100%相比对照组，产酸速率有所降低。

综合上述实验结果可知，通过在发酵过程中低速全程流加全营养策略，在适宜的流加浓度下，能有效提高菌体生物量，菌体在对数期生长速率有所提高，在发酵后期菌体衰退放缓，延长了菌体稳定期和高速产酸期，解决了发酵后期由于营养不足引起的菌体活力不足的问题，使得产量较使用全营养流加策略前大幅提升。但发酵前期培养基底料营养十分充足，在这段时间流加全营养培养基有可能影响菌体生长，增加发酵结束时发酵液营养剩余，造成浪费、提取困难、产品质量下降等问题[17]。

2.2 恒速分时流加策略

为了进一步优化发酵培养过程，提高产酸量和糖酸转化率，并解决发酵前期因流加料导致培养基营养过剩、发酵后期菌体活力下降、产酸动力不足等问题，本实验在1.5.1实验方法的基础上，结合2.1得出的实验结果，进一步改进流加策略。流加料采用浓度为50%的发酵底物培养基，并对全营养流加的最佳开始时间进行探究。分别在发酵5，10，15，20 h开始流加全营养，直至发酵结束，分析在菌体生长的不同阶段流加全营养对发酵生物量、生长速率、L-赖氨酸产量和单位产酸速率[18]等的影响，结果见图5～图8。

图5 发酵不同时间流加全营养培养基对菌体生物量的影响

图6 发酵不同时间流加全营养培养基对菌体生长速率的影响

图7 发酵不同时间流加全营养培养基对产量的影响

图8 发酵不同时间流加全营养培养基对产酸速率的影响

由图5可知，对照组和5 h开始流加的组别菌体在22～25 h开始出现菌体衰亡。在发酵的10，15，20 h开始流加流加料，菌体生长速度均有提高；菌体生物量稳定期延长，最终生物量分别较未流加流加料的对照组提高23.1%、16.1%、10.0%。

由图6可知，10 h开始流加时，菌体生长速率下降放缓，最终生长速率平稳。

由图7可知，发酵5，10，15，20 h开始流加全营养，最后L-赖氨酸产量分别为218，255，220，181.5 g/L，相较于对照组167 g/L有明显提高，分别提高了30.5%、52.7%、31.7%、8.7%。由实验结果可知，5 h流加不能解除营养过剩导致的菌体中毒，导致菌体内部代谢流紊乱，影响菌体产酸活力。发酵20 h流加，菌体已经开始衰退，流加全营养无明显效果。

由图8可知，5，10，15 h的L-赖氨酸最高产酸速率分别为23%、42.2%、7.3%，相较于对照组明显提高；20 h开始流加，已经在发酵的后期，产酸高峰已经结束，产酸速率相较于对照组无明显变化。

综合上述实验结果可知，在发酵前期流加全营养，对菌体生物量、产酸能力、菌体活力有一定帮助，但效果不明显；在菌体达到稳定期，发酵刚开始进入高速产酸期时开始流加全营养，能够长时间维持菌体活力和产酸能力[19]，延长高速产酸期，延缓菌体衰亡，有效地解决了发酵前期底物抑制和发酵后期菌体过早衰亡的问题；发酵后期流加全营养，此时菌体已经开始衰亡，流加全营养可以恢复部分菌体活力，但效果不明显，意义不大[20-21]。

2.3 全营养流加对糖酸转化率的影响

由表2可知，在发酵时间同为36 h的条件下，优化后的平均补糖速率比优化前高40.06%，补糖量高出397 g，糖酸转化率提高9%，产酸量提高52.7%。

表2 全营养流加对糖酸转化率的影响

3 结论

在谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸的过程中，L-赖氨酸的产量及糖酸转化率是评估菌株性状和发酵产酸能力的核心指标。为解决发酵后期菌体活力不足、高速产酸期时间较短等问题，通过探究梯度浓度低速全程全营养流加策略，增强了发酵前期菌体的生长能力，提高了菌体生物量，延长了菌体生长稳定期。全营养流加料为发酵培养基浓度50%时，L-赖氨酸产量大幅提高，达到235 g/L，比对照组提高了40.7%。为探究在不同发酵阶段采用全营养流加策略对发酵产酸和糖酸转化率等的影响，根据1.5.2的实验方法，采用恒速分时流加策略，最终生物量为144，较优化前提高了23.1%，L-赖氨酸产量为255 g/L，较优化前提高了64.5%，糖酸转化率为70.3%，较优化前提高了9%。最终发现通过在发酵10 h时流加发酵培养基底物浓度50%的流加料效果最优。采用全营养流加策略能有效地提高产量，一定程度上提高了糖酸转化率。在工业生产中，在高速产酸期初始阶段，可以采用流加发酵培养基浓度50%的全营养流加策略，能够有效提高产量，提高糖酸转化率，降低原料成本。