细胞外信号调节蛋白激酶1/2抑制药对慢性阻塞性肺疾病小鼠气道高分泌黏蛋白5ac的作用机制

2021-06-02覃英娇周向东钟有清王杰刘峰

实用医学杂志 2021年9期

覃英娇周向东，2，3 钟有清王杰刘峰

1海南医学院第一附属医院呼吸内科（海口570102）；2急救与创伤研究教育部重点实验室（海口571199）；3中国医学科学院海岛急救医学创新单元（海口571199）

随着环境污染及吸烟人数的增多，慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）致病率和病死率逐年上升，严重威胁人类身体健康［1］。COPD 作为呼吸科常见的疾病，其发病机理复杂且多变［2］。有研究［2］表明，该病的主要发病机制为慢性炎症引起的肺组织破坏。作为一种慢性炎症类疾病，该病受多种调控因素影响，吸烟是导致COPD 的重要危险因素之一，香烟中所含的活性氧类物质能够通过某些通路诱导相关黏液蛋白的表达，从而促进气管黏液高分泌［3］。近年来研究表明，muc5ac 是气管中最主要的分泌性黏蛋白之一，而气管黏液高分泌是COPD 的重要病理特征之一，它可以加速肺功能下降进程，加重呼吸道气流阻塞，造成气管内感染，增加COPD 患者的住院率和病死率［4］。细胞外信号调节激酶1 和2（extracel⁃lular⁃signal regulated kinase1/2，ERK1/2）在COPD 患者机体内被激活，在健康人体内ERK1/2 水平下调，但其作用机制尚不清楚［5］。因此，本研究通过建立COPD 模型，观察ERK1/2 抑制药对COPD 小鼠气道高分泌muc5ac 的作用机制，为临床治疗COPD 提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物ICR 小鼠60 只，雄性，体质量18～20 g，由济南金丰实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（鲁）20180006，于清洁通风的环境中适应性饲养小鼠1 周，保持温度25 ～28 ℃，湿度60%～65%。

1.1.2 主要试剂和仪器ERK1/2 抑制药（上海辅仁医药研发有限公司），沙丁胺醇注射剂（批准文号：国药准字H31022208，上海禾丰药业有限公司），Trizol 试剂（Invitrogen 公司），ELISA 试剂盒（英国Solarbio 公司），白细胞介素4（Interleukin，IL⁃4）、干扰素γ（Interferon⁃gamma，IFN⁃γ）ELISA 试剂盒（北京同立海源生物科技有限公司），兔抗小鼠muc5ac、ERK1/2、p⁃ERK1/2 单克隆抗体（艾美捷生物科技有限公司），HRP 标记的山羊抗兔IgG（美国Abcam 公司），实时荧光定量PCR 仪、SpectraMax 190 酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模及分组随机取45 只小鼠，采用鼻腔滴入脂多糖联合烟熏的方法建立COPD 小鼠动物模型［6］。分别在第1、14 和34 天向小鼠鼻腔内滴入200 μL 脂多糖（脂多糖浓度为1 g/L），第2 ～35 天（除第14、34 天）采取熏香烟法，12 支/次，30 min/次。将建模成功的45 只小鼠随机分为模型组、抑制药组、西药组，各15 只。剩余15 只为对照组，分别于第1、14 和34 天向鼻腔内滴入同等量的0.9%氯化钠溶液。连续5 周。

1.2.2 干预方法建模成功后5 h 进行干预。抑制药组：腹腔注射30 mg/kg U0126，西药组：腹腔注射沙丁胺醇0.4 mg/次（用5%葡萄糖注射液20 mL稀释注射）。对照组和模型组：腹腔注射等量生理盐水，其他时间正常饲养。各组小鼠每天干预1次，共7 d。

1.2.3 肺功能测定干预后8 h 进行肺功能测定，腹腔注射1%戊巴比妥钠（按50 mg/kg）麻醉小鼠，仰卧位，分离暴露气管后在颈正中部位将气管切开，插入连接三通管的气管插管后固定。测定小鼠0.3 s 用力呼气量（forced expiratory volume in 0.3 second，FEV0.3），用力肺活量（forced vital capacity，FVC）及两者比值。

1.2.4 小鼠血清制备和IL⁃4、IFN⁃γ水平检测称取小鼠体质量，经腹腔注射1%戊巴比妥钠（按50 mL/kg）麻醉小鼠，腹主动脉取血法从小鼠体内取血1 mL，3 000 r/min，离心20 min，离心半径为10 cm，取血清。按ELISA 试剂盒操作流程检测小鼠血清中IL⁃4、IFN⁃γ的含量。

1.2.5 HE 染色观察肺组织病理学变化取固定后的小鼠右肺中叶组织，自来水冲洗，放入10%福尔马林中使肺组织的蛋白变性凝固，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡处理，待石蜡完全浸入组织块后包埋，冷却凝固后切片，染色封片，光镜观察肺组织病理形态学变化。

1.2.6 RT⁃PCR 检测肺组织中muc5ac、ERK1/2 mRNA 的表达取保存在液氮中的肺组织80 mg，于冰上充分研磨，提取总RNA。检测RNA的纯度和浓度，并逆转录为cDNA，进行荧光定量PCR，总反应体系为20 μL：cDNA 2 μL，上游引物1.5 μL，下游引物1.5 μL，Taq DNA 聚合酶10 μL，双蒸水5 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸15 s，共40 个循环。以β⁃actin 为内参基因，采用2⁃△△CT法计算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.7 Western blot 检测肺组织muc5ac、ERK1/2、p⁃ERK1/2 蛋白表达取液氮中的肺组织70 mg，BCA 法提取总蛋白并定量，100 ℃水浴使蛋白变性。进行SDS⁃PAGE 电泳，电泳结束后转膜至PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入1∶2 000 稀释的muc5ac、ERK1/2、p⁃ERK1/2、β⁃actin 一抗，4 ℃过夜孵育，1×TBST 洗膜5 min×6 次，加入HRP 标记的山羊抗兔二抗（1∶10 000），室温孵育2 h，1×TBST洗膜5 min×6 次，加入ECL 显影液显影，采用Image J 软件分析图像，结果以目的蛋白/β⁃actin 表示。

1.3 统计学方法采用SPSS 25.0统计学软件分析数据，计量资料以表示，资料符合正态分布，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，样本两两比较采用LSD⁃t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各肺功能指标检测比较与对照组比较，模型组、抑制药组和西药组的FEV0.3、FVC 以及FEV0.3/FVC 明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，抑制药组和西药组的FEV0.3、FVC 以及FEV0.3/FVC 明显升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠肺功能指标检测比较Tab.2 Comparison of pulmonary function indexes of mice in each group ±s

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05

组别对照组模型组抑制药组西药组F 值P 值FEV0.3（mL）5.38±0.54 3.21±0.33a 4.13±0.42ab 4.16±0.42ab 63.120＜0.001 FVC（mL）5.74±0.58 3.73±0.38a 4.62±0.47ab 4.64±0.48ab 43.585＜0.001 FEV0.3/FVC（%）93.73±9.77 86.06±8.64a 89.39±9.23ab 89.65±9.21ab 4.183 0.01

2.2 各组小鼠血清中IL⁃4、IFN⁃γ水平比较与对照组比较，模型组、抑制药组和西药组的IL⁃4 水平降低，IFN⁃γ水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，抑制药组和西药组的IL⁃4 水平升高，IFN⁃γ水平降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠血清中IL⁃4、IFN⁃γ水平比较Tab.3 Comparison of IL⁃4 and IFN⁃γ levels in serum of mice in each group ±s

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05

组别对照组模型组抑制药组西药组F 值P 值IL⁃4（pg/mL）34.16±3.51 24.35±2.50a 31.22±3.22ab 32.13±3.30ab 27.311＜0.001 IFN⁃γ（pg/mL）39.31±4.11 66.53±6.71a 45.36±4.62ab 43.22±4.41ab 87.087＜0.001

2.3 肺组织病理学变化对照组小鼠肺泡结构未见明显异常。模型组小鼠肺泡不规则扩大，部分肺泡壁塌陷，纤毛黏缩，肺间质内有炎性细胞浸润。抑制药组和西药组小鼠肺组织仍有肺大泡形成，但肺组织和气道炎性细胞浸润相对减少，纤毛排列相对整齐。见图1。

图1 肺组织病理学变化（HE×200）Fig.1 Pathological changes of lung tissue（HE×200）

2.4 各组小鼠肺组织中muc5ac、ERK1/2 mRNA的表达比较与对照组比较，模型组、抑制药组和西药组muc5ac mRNA 的表达量升高（P＜0.05）。与模型组比较，抑制药组和西药组muc5ac mRNA的表达量降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠肺组织中muc5ac、ERK1/2 mRNA 水平比较Tab.4 Comparison of muc5ac and ERK1/2 mRNA levels in lung tissue of Mouses in each group ±s

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05

组别对照组模型组抑制药组西药组F 值P 值muc5ac 1.00±0.11 3.12±0.35a 1.78±0.18ab 1.75±0.18ab 234.170＜0.001 ERK1/2 2.22±0.25 2.31±0.24 2.24±0.24 2.26±0.23 0.388 0.762

2.5 各组小鼠肺组织中muc5ac、ERK1/2、p⁃ERK1/2蛋白表达比较与对照组比较，模型组、抑制药组和西药组的muc5ac、p⁃ERK1/2 蛋白表达量升高（P＜0.05）。与模型组比较，抑制药组和西药组的muc5ac、p⁃ERK1/2 蛋白表达量降低（P＜0.05）。见表5，图2。

3 讨论

COPD 是由空气中的有害颗粒物造成气道或肺泡异常所引起的疾病［7］。我国20 岁以上人群COPD 患病率为49.3%，且年龄越大，患病率越高［8-10］。研究表明，COPD 与呼吸道炎症密切相关，炎症反应导致呼吸道黏液大量分泌，细菌大量滋生，形成恶性循环，加重气流阻塞和炎症反应［11］。ERK1/2抑制药通过调节muc5ac的分泌，参与COPD疾病发展过程，为临床治疗COPD提供参考。

ERK1/2 是一类脯氨酸导向的苏氨酸/丝氨酸激酶，可以磷酸化与脯氨酸相邻的苏氨酸/丝氨酸［12-13］。研究［14-15］显示，ERK1/2 是生物体内重要的信号转导分子，参与炎症反应及细胞分化、凋亡等过程。研究［16］证明，人肾癌细胞内ERK 的激活可诱导血红素氧合酶⁃1 表达增多，保护肺组织。已有研究［17］表明，在慢性支气管哮喘小鼠气道平滑肌细胞中，ERKl/2 能够促进气道平滑肌细胞的增殖，并且在哮喘气道重建中发挥着重要作用。此外，在高血压、糖尿病血管病变以及血管重建术后再狭窄等血管疾病中，通过激活ERKl/2 信号分子，诱导血管平滑肌细胞增殖，促进疾病发生［18］。U1026是ERK1/2上游激酶抑制剂，可以抑制ERK1/2 活化并阻断ERK1/2 信号转导通路［19］。本研究结果显示，抑制药组和西药组的FEV0.3s、FVC 以及FEV0.3s/FVC 明显升高，IL⁃4 水平升高，IFN⁃γ水平降低，HE染色结果也表明，抑制药组的肺组织病理学变化改善，提示U1026能改善小鼠COPD症状。

表5 各组小鼠肺组织中muc5ac、ERK1/2、p⁃ERK1/2 蛋白水平比较Tab.5 Comparison of muc5ac，ERK1/2 and p⁃ERK1/2 protein levels in lung tissues of mice in each group±s

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05

组别muc5acERK1/2p⁃ERK1/2对照组0.89±0.121.42±0.180.90±0.12模型组1.43±0.18a1.43±0.191.32±0.19a抑制药组西药组F 值P 值1.02±0.13ab 1.00±0.13ab 64.015＜0.001 1.42±0.18 1.44±0.18 0.041 0.989 1.03±0.14ab 1.01±0.14ab 69.028＜0.001

图2 肺组织中muc5ac、ERK1/2、p⁃ERK1/2 蛋白表达水平比较Fig.2 Comparison of muc5ac，ERK1/2 and p⁃ERK1/2 protein expression levels in lung tissue

黏液的主要成分是黏蛋白，muc5ac 是气管主要的分泌性黏蛋白［20］，也是衡量气道上皮黏液分泌的指标之一，且黏蛋白的数量和质量决定了气道黏液的理化性质［21-22］。既往研究表明，COPD 患者气道上皮muc5ac mRNA 明显高于正常健康人，并且指出COPD 患者的肺功能与muc5ac 的基因表达量呈负相关，说明muc5ac 表达增加是气道黏液高分泌的重要因素［23］。研究［17］证实，ERK1/2 信号通路对粘液分泌的下游信号起调控作用，过表达p⁃ERK1/2，会引起黏液高分泌。本研究发现，COPD 小鼠注射ERK1/2 抑制药U1026 可以降低p⁃ERK1/2蛋白表达量，muc5ac mRNA和蛋白表达量，提示U1026 通过抑制ERK1/2 信号通路，下调muc5ac 表达，减少黏液，减轻炎症，缓解COPD症状。

综上所述，ERK1/2 抑制药U0126 对COPD 小鼠的状况有明显改善作用，可能是通过抑制ERK1/2 信号通路，下调muc5ac 表达，改善COPD 症状，为临床COPD 治疗提供理论指导。然而，ERK1/2 信号通路作用机制复杂，ERK1/2 和muc5ac的具体关系，以及ERK1/2 信号通路相关基因是如何表达的还不清楚，需要进一步证实。