异常增加的α⁃突触核蛋白对帕金森病模型小鼠黑质及结肠多巴胺受体D1的表达影响

徐晓峰 罗汉将 莫琼 左丽丝 黄秀仙 陈敏

桂林医学院附属医院神经科学实验室，广西神经系统疾病临床研究中心，广西脑与认知神经科学重点实验室（广西桂林541001）

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是常见的好发于中老年人的神经退行性疾病［1］，PD 患者的黑质纹状体系统及肠神经系统均出现α⁃突触核蛋白（α⁃synuclein，α⁃Syn）异常表达、聚集和多巴胺（dopamine，DA）能神经元变性［2-3］。现有PD 动物模型研究证明，黑质致密部酪氨酸羟化酶（tyro⁃sine hydroxylase，TH）阳性神经元减少及纹状体DA含量降低，多巴胺受体D1（dopamine receptor D1，D1DR）表达下降［4-5］。而结肠等消化器官中D1DR的表达是否发生变化尚不清楚。异常增加的α⁃Syn 是否影响脑及结肠中D1DR 的表达亦未探明。然而，DA 及DR 在胃肠道的表达对胃肠运动、胃酸分泌、胃黏膜血氧供应等胃肠功能的调节起重要作用［6］。因此明确PD 发生时胃肠道D1DR 的改变对PD 非运动症状发生机制的探索有重要临床意义。本研究拟通过C57BL/6J 小鼠纹状体内注射α⁃Syn 预成型纤维（pre⁃formed fibrils，PFF）建立PD 动物模型，探索异常增加的α⁃Syn 所致黑质和结肠中D1DR 变化的潜在联系。

1 材料与方法

1.1 实验动物野生C57BL/6J雄性小鼠16只，8周龄，体质量约25 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于桂林医学院附属医院动物研究中心，恒温恒湿，自由饮食、饮水。实验及实验中外科手术均符合实验动物护理和使用研究指南，并已获得桂林医学院实验动物伦理委员会批准（No.2019⁃0010）。

1.2 主要试剂及仪器α⁃Syn PFF（StressMarq，加拿大），D1DR 抗体（DF7097，Affinity，美国），α⁃Syn抗体（610787，BD，美国），TH 抗体（AB152，Milli⁃pore，美国），β⁃actin 抗体（C1313，北京普利莱，中国），Alexa⁃fluor 488 标记山羊抗兔IgG、兔SPN 试剂盒（ZF0511、SPN⁃9001，北京中杉金桥，中国），脑立体定位仪（深圳瑞沃德，中国），小鼠旷场实验分析系统（上海欣软，中国），荧光显微镜（Nikon，日本），ODYSSEY 双色红外荧光成像系统（LI⁃COR，美国）。

1.3 动物模型制备通过行为学训练，选取运动能力接近的16 只C57BL/6J 小鼠，随机分为对照组（n= 8）和模型组（n= 8）。用4%的水合氯醛麻醉后，通过立体定位注射将2 μL 1 mg/mL 的α⁃Syn PFF 缓慢注射至模型组右侧纹状体内（前囟前0.2 mm，旁开2.0 mm，纵深3.0 mm），对照组注射等体积0.01M PBS（pH 7.4）。术后饲养6 个月，行为学检测小鼠运动能力差异，取脑及结肠组织进行检测。

1.4 行为学训练及检测造模前，小鼠进行3 次平衡杆、爬杆训练。造模6 个月后进行平衡杆、爬杆实验及旷场实验。平衡杆实验：100 cm × 1 cm× 1 cm 平衡杆水平置于离地50 cm 处，将距两端10 cm 处分别定为起、终点。记录小鼠从起点到达终点的时间。爬杆实验：100 cm × 1 cm × 1 cm 长杆垂直于地面，记录小鼠从杆顶端起点至终点所用时间。旷场实验：记录小鼠在50 cm × 50 cm ×40 cm 旷场箱内自由运动10 min 的运动轨迹及平均运动速度。

1.5 Western blot（WB）实验方法［7］简述如下：取小鼠黑质及距肛门4 ～6 cm 处结肠，RIPA 裂解液冰浴裂解，12 000 转离心获取上清，BCA 法测定蛋白浓度，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转印至PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h 后孵育兔源TH 抗体（1∶10 000）、鼠源α⁃Syn 抗体（1∶1 000）、兔源D1DR 抗体（1∶2 000）、内参β⁃actin（1∶10 000）4 ℃过夜，对应源性荧光二抗（1∶10 000）室温1 h，ODYSSEY 双色红外荧光成像系统扫膜。利用Im⁃ageJ 软件分析目的蛋白与内参的光密度值比值，对目的蛋白的表达量进行半定量分析。

1.6 免疫组化（immunohistochemistry，IHC）及免疫荧光（immunofluorescence，IF）IHC：小鼠麻醉后，37 ℃预热生理盐水灌流心脏，冲净血液后更换为预冷的4%多聚甲醛灌注固定。剥离鼠脑及结肠组织，后固定48 h 及蔗糖梯度脱水后进行冰冻切片，厚度20 μm。将组织切片置于0.3%过氧化氢30 min，用含0.3% Triton⁃X 100 的PBS 通透过夜，2%山羊血清封闭后，4 ℃孵育兔源D1DR抗体（1∶500）、兔源TH 抗体（1∶10 000）48 h，兔SPN 试剂盒识别一抗后用二氨基联苯胺（DAB）溶液显色，脱水封片后于显微镜下观察，以细胞质着棕黄色为阳性细胞，随机选择5 个视野拍照，记录阳性细胞数。IF：一抗孵育后，使用山羊抗兔Alexa⁃fluor 488（1∶2 000）室温孵育1 h。用含DAPI 的抗荧光衰减封片剂封片，倒置荧光显微镜观察。

1.7 统计学方法使用Image J 软件进行图像分析，利用GraphPad Prism 8.0.2 软件进行数据统计及分析，数据以均值±标准差表示，t检验分析评估组间统计学差异，连续变量相关性分析用Pearson相关分析。P＜0.05 时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠PD 模型建立行为学结果显示，与对照组相比，6 个月后模型组小鼠通过平衡杆及爬杆所需时间延长（P＜0.001，表1），旷场平均运动速度减慢（P＜0.001，表1），运动轨迹集中在旷场四周且明显稀疏（图1），表现其出现运动迟缓、探索行为减少等PD 典型症状。同时，IHC 结果显示模型组小鼠黑质TH阳性神经元明显减少（P＜0.01，图2），提示纹状体立体定位注射α⁃Syn PFF 构建小鼠PD模型成功。

表1 小鼠行为学实验结果Tab.1 Behavioral experimental results of mice x±s

图1 小鼠旷场实验运动轨迹Fig.1 Motion trail in open field test

2.2 异常增加的α⁃Syn下调小鼠黑质D1DR表达WB 结果显示，模型组小鼠黑质中α⁃Syn 表达增加（P＜0.001，图3A、C），D1DR 及TH 表达明显低于对照组（P＜0.01，图3A、B；P＜0.05，图3A、D），同时IF 结果也表现为模型组D1DR 阳性神经元减少，荧光强度减弱（P＜0.01，图4），表明异常增加的α⁃Syn 可以下调黑质D1DR 的表达。

2.3 结肠组织D1DR、TH 表达降低且与黑质对应表达改变呈正相关WB 显示，模型组结肠中D1DR 及TH 的表达低于对照组（P＜0.01，图5），且其相对表达量与黑质中的相对表达量呈正相关（r=0.894 3、0.902 6，P＜0.05，图7A、B）。此外，IHC 结果亦出现模型组D1DR 阳性细胞数减少（P＜0.05，图6），与WB 结果一致。

3 讨论

本研究通过纹状体立体定位注射α⁃Syn PFF制备α⁃Syn 异常增加的小鼠PD 模型，通过WB、IHC及IF 等检测手段发现PD 小鼠黑质及结肠中D1DR及TH 表达出现平行下降，为结肠活检应用于评估早期PD 患者中枢神经病理提供了实验基础。

图2 小鼠黑质TH（IHC）Fig.2 IHC results of TH in substantia nigra of mice

图3 小鼠黑质D1DR、α⁃Syn、TH 蛋白的表达Fig.3 Expression of D1DR，α⁃Syn and TH in substantia nigra of mice

图4 小鼠黑质D1DR（IF）Fig.4 IF results of D1DR in substantia nigra of mice

图5 小鼠结肠D1DR、TH 蛋白表达Fig.5 Expression of D1DR，TH in the colon of mice

图6 小鼠结肠D1DR（IHC）Fig.6 IHC results of D1DR in the colon of mice

PD 的典型临床表现除常见的运动症状外，还伴有便秘、吞咽困难，睡眠异常，抑郁等非运动症状［8-9］。在出现运动症状之前，许多PD 患者常出现营养不良、便秘等消化道症状［10-11］。越来越多的证据表明，PD 的临床诊断大多发生在疾病进展的较晚阶段［12］，而其病理改变可能更早地起源于胃肠道，进而进展到大脑［13-14］。BRAAK 假说［15］认为，在PD 患者中，消化系统黏膜下神经丛的α⁃Syn错误折叠和聚集可通过一系列连续的投射神经元到达大脑。KIM 等［16］验证了α⁃Syn 造成的病理改变可通过迷走神经以固定的方式从胃肠道传播到腹侧中脑，选择性地破坏黑质致密部DA 能神经元。在PD 中，基底神经节回路中黑质⁃纹状体通路的退化［17］和多巴胺能信号的失衡导致患者出现运动障碍［18-19］。通过在大鼠中脑腹侧部过表达人源α⁃Syn，ULUSOY 等［20］在节前迷走神经轴突末梢及胃壁内脏运动神经末梢均探测到外源性α⁃Syn的存在，提示了PD 患者α⁃Syn 在肠神经系统的沉积也可能经迷走神经来自中枢神经系统。因此，本研究推测，α⁃Syn 的异常增加与DA 能神经元退化在中脑黑质和结肠中存有潜在联系。生理条件下，α⁃Syn 维护突触完整性和稳定性、参与调节DA的生物合成，对正常神经活动具有重要作用［21］。而在病理情况下，α⁃Syn 可寡聚化为可溶性原纤维导致路易小体的形成［22］。已有研究证实，野生型非转基因小鼠单侧纹状体内接种合成的α⁃Syn 原纤维可导致类似PD 的路易小体出现［23］。

图7 小鼠黑质及结肠D1DR、TH 的相关性分析Fig.7 The relevance analysis of D1DR，TH in substantia nigra with colon of mice

本研究通过纹状体立体定位注射α⁃Syn PFF制备小鼠PD 模型，通过行为学检测发现模型组小鼠平衡杆及爬杆所需的时间明显延长，平均运动速度减慢，提示注射α⁃Syn PFF 的小鼠出现了明显的运动障碍。WB 及IHC 检测结果显示黑质TH 表达下降及阳性神经元明显减少，WB 及IF 结果显示D1DR 表达下降及D1DR 阳性神经元减少。上述结果表明，异常增加的α⁃Syn 可以导致DA 能神经元变性并抑制D1DR 的表达。同时，本研究发现模型组小鼠结肠中D1DR 及TH 均低于对照组小鼠，与其在黑质中的表达改变呈正相关。提示α⁃Syn 的异常增加可能通过影响结肠的D1DR 及TH 的表达导致胃肠功能紊乱。

本研究采用小鼠纹状体内注射α⁃Syn PFF 构建PD 模型能较好地模拟PD 患者的病理情况，对结肠组织相关分子表达的研究将有助于探讨PD患者胃肠道症状发生的机制。但鉴于样本量限制，未来将扩大动物模型样本量来进行实验分析，重点关注α⁃Syn是如何抑制D1DR表达的分子机制，进一步探讨PD中运动症状与胃肠道症状的相互关系。

综上所述，本研究发现在纹状体立体定位注射α⁃Syn PFF 制备的小鼠PD 模型中，黑质及结肠D1DR、TH 均表达降低且存在平行的改变，该发现对研究PD 患者胃肠道症状的发生机制有一定的提示作用，为结肠活检应用于评估早期PD 患者中枢神经病理提供了实验基础。