miR⁃330⁃3p靶向丙酮酸激酶M2型对胃癌细胞增殖、凋亡及有氧糖酵解进程调控机制研究

刘磊 赵羲和 田忠

中国医科大学附属盛京医院1普通外科，2肿瘤科（沈阳110023）

胃癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，我国2015年胃癌新发及死亡例数分别为40.3万、29.1万人次，分别位居全部恶性肿瘤的第2、3位［1］，尽管外科手术及其他治疗方式有了长足的发展，但胃癌患者的生存率及预后仍不乐观，明确胃癌发生及发展的机制，从分子水平上寻找早期诊断及靶向治疗措施的是当前癌症研究的重点及难点［2］。近年来的研究认为，丙酮酸激酶M2 型（PKM2）介导的有氧糖酵解过程在肿瘤细胞的发生及发展中扮演重要角色，瓦伯格效应认为，癌细胞需要获取足够的能量来维持细胞生长、增殖，大部分癌组织主要利用有氧糖酵解过程快速供能，有氧糖酵解活性在癌细胞增殖及血管新生过程均发挥重要作用［3-4］。临床研究表明，在包括胃癌的诸多恶性肿瘤组织中均可检测到PKM2 水平的明显升高，且其水平与患者低生存密切相关［5-6］。microRNA 是一种非编码RNA，主要在转录、表观遗传学水平上调节基因表达，从而影响一系列生理过程。miR⁃300⁃3p 是一种肿瘤标记基因，既往已被证实在肝癌［7］、肺癌组织［8］中存在低表达，且其水平与细胞恶性生物学行为相关；HWANG 等［9］开展的一项高通量研究显示，miR⁃300⁃3p 在胃癌细胞系及组织中表达下降。目前miR⁃300⁃3p 与PKM2 及糖酵解途径的关系仍较少有研究涉及，本研究采用转染实验，在胃癌细胞株中过表达及干扰miR⁃300⁃3p、PKM2 表达，观察miR⁃300⁃3p 与PKM2 表达量的变化，并采用增殖、侵袭、凋亡实验分析细胞生物学行为的改变，探讨miR⁃300⁃3p 及PKM2 通路在胃癌生长增殖中的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料人类胃癌细胞株SGC⁃7901；人类正常胃粘膜上皮细胞GES⁃1；均购自中国科学院细胞库。

1.2 实验仪器与试剂细胞培养箱（日本SANYO公司）；倒置显微镜（日本Olympus 公司）；电泳仪（北京六一仪器厂）；紫外分光光度计（美国Thermo公司）；凝胶成像仪（美国BIO⁃RAD 公司）；PCR 仪（美国BIO⁃RAD 公司）；实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）。

胎牛血清（WESTEN 公司）；Trizol（Invitrogen 公司）；RNA 反转录试剂盒（美国BIO⁃RAD 公司）；CCK⁃8（Dojin DO 公司）；RAPI（Solarbio 公司）；Matrigel 基质胶（Solarbio 公司）；Transwell 小室（美国Corning 公司）；葡萄糖含量检测试剂盒（北京百奥博莱科技有限公司）；乳酸含量检测试剂盒（艾美捷生物科技有限公司）；HK 试剂盒（武汉博士康生物工程有限公司）；LDH 试剂盒（上海珏博生物科技有限公司）；荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国Biovision 公司）；PKM2、GLUT1、HK2、Bax、Caspase⁃3 单克隆抗体（Santa Cruz 公司）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔、兔抗羊单克隆抗体（Santa Cruz 公司）；蛋白提取试剂盒、BCA 试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞复苏及培养取胃癌细胞系、正常胃粘膜上皮细胞置于0 ℃条件下解冻，采用DMEM 培养基连续培养24 h（37 ℃、5%CO2）；以3 000 r/min速度（离心半径8.5 cm）离心5 min，取沉淀放入DMEM 培养基重悬，继续培养24 h；连续进行细胞传代3 次后进行细胞计数，取4 × 105/孔接种至培养基上，培养至细胞融合80%作用，更换不含胎牛血清的培养基。

1.3.2 细胞转染取对数期细胞，将miR⁃NC、miR⁃330⁃3p⁃inhibitor、miR⁃330⁃3p⁃mimcs 转染至胃癌细胞中，分别记为miR⁃NC 组、miR⁃330⁃3p⁃inhibitor组、miR⁃330⁃3p⁃mimcs 组，将miR⁃330⁃3p⁃inhibitor 分别与PKM2⁃NC、PKM2⁃shRNA 共转染至胃癌细胞中，记为miR⁃330⁃3p⁃inhibitor+PKM2⁃NC 组、miR⁃330⁃3p⁃inhibitor+PKM2⁃shRNA 组；将miR⁃330⁃3p⁃mimcs 分别与LV⁃NC、LV⁃PKM2 共转染至胃癌细胞中，记为miR⁃330⁃3p⁃mimcs+LV⁃NC 组、miR⁃330⁃3p⁃mimcs+LV⁃PKM2 组。具体转染方法：取对数期生长的胃癌细胞系，以1.5 × 105/孔接种于六孔板中，采用DMEM 培养基稀释序列至200 μmol/L，取2 μL Lipofectamin2000 RNAiMAX 加入到稀释的转染序列中混合，室温孵育20 min，将复合物加入六孔板内，而后每孔加入1.9 mL DMEM 培养基，使得每孔转染浓度为100 nmol/L，在37 ℃、5%CO2条件下孵育8 h，而后换成5%培养基继续培养40 h。

1.3.3 CCK⁃8 检测细胞增殖能力取上述1.3.2 中处理细胞，采用胰蛋白酶处理，制备细胞悬液，调整细胞数量为5 000 ～10 000 个/孔，培养24、48、72 h 时取细胞，加入10 μL CCK⁃8 溶液孵育4 h，测定吸光度值。

1.3.4 Transwell 实验检测细胞侵袭能力取稀释（1∶8）后的Matrigel 均匀涂布在上层小室内，孵育4 h 后加入无血清DMEM 培养基重悬，向上室内加入细胞悬液（对数期细胞，细胞密度约为5×104/mL），下室加入含有血清的培养基，将装置置于37 ℃、5%CO2培养箱孵育24 h，取出小室，采用PBS 冲洗并小心去除膜上的Matrigel 及细胞，采用多聚甲醛固定并加入结晶紫染料染色30 min，PBS 冲洗、晾干后置于倒置显微镜下观察。

1.3.5 Annexin V/PI 法检测细胞凋亡检测取细胞收集于流式管内，PBS 清洗3 遍，以1 000 r/min 离心10 min，取沉淀以200 μL 结合缓冲液重悬细胞，加入FITC 标记的Annexin V 溶液及PI 溶液，混匀后室温避光孵育20 min，加入300 μL 缓冲液混匀，流式细胞仪上样检测细胞凋亡。

1.3.6 有氧糖酵解作用测定（1）葡萄糖利用率及乳酸生成量测定：取上述培养细胞，采用葡萄糖含量试剂盒及乳酸试剂盒说明书进行操作，检测培养基葡萄糖及乳酸含量，计算葡萄糖利用率及乳酸生成量。（2）己糖激酶（HK）、乳酸脱氢酶（LDH）活性测定：采用HK 及LDH 试剂盒进行操作，普通分光光度计测定吸光度值，根据标准趋势计算活性。

1.3.7 荧光素酶报告基因检测miR⁃330⁃3p 靶向PKM2 调控能力在TargetScan 数据库序列寻找结合位点，构建野生型及突变型基因靶点PKM2 的荧光素酶表达载体，将载体分别与miR⁃NC、miR⁃330⁃3p 共转染至胃癌细胞系内，进行双荧光素酶报告实验测定。

1.3.8 基因及蛋白表达（1）逆转录聚合酶链式反应检测：主要涉及miR⁃330⁃3p mRNA 表达。取处理后的细胞，采用Trizol 法提取总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，进行聚合酶链式反应扩增，琼脂糖凝胶检测核酸条带亮度，mRNA 表达量为目的基因与内参表达量的比值。（2）Western blot 法：主要涉及PKM2、GLUT1、HK2、Bax、Caspase⁃3 蛋白的表达。取处理后的细胞提取总蛋白，配置SDS⁃PAGE 胶，以80 μg 蛋白量加入点样孔内，电泳后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，转膜完毕后采用脱脂牛奶封闭3 h，依次加入一抗、二抗，洗脱后加入发光试剂，置于显像仪照相，以目的基因与内参表达灰度值作为蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0 进行分析，数据以（）表示，组间比较行单因素方差分析及t检验，以P＜0.05 表示差异具统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌细胞系及胃粘膜上皮细胞miR⁃330⁃3p、PKM2 表达RT⁃PCR 结果显示，胃癌细胞系及胃粘膜上皮细胞miR⁃330⁃3p 表达量分别为（0.33 ±0.10）、（0.20±0.05），差异有统计学意义（P＜0.05）；Western blot 显示，胃癌细胞系及胃粘膜上皮细胞PKM2蛋白表达量分别为（0.34±0.10）、（1.01±0.23），两者差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 胃癌细胞系及胃粘膜上皮细胞miR⁃330⁃3p、PKM2表达Fig.1 Expression of miR⁃330⁃3p and PKM2 in gastric cancer cell lines and gastric mucosal epithelial cells

2.2 miR⁃330⁃3p 与PKM2 的靶向关系分析生物信息学显示，miR⁃330⁃3p 与PKM2 存在结合位点；荧光素酶报告基因检测结果显示，与miR⁃NC 组比较，miR⁃330⁃3p PKM2 野生型荧光素酶活性降低（P＜0.05）。见图2。

2.3 miR⁃330⁃3p 转染对胃癌细胞PKM2 表达的影响与miR⁃NC 组比较，miR⁃330⁃3p⁃inhibitor 组PKM2 表达升高，miR⁃330⁃3p⁃mimcs 组PKM2 表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图2 miR⁃330⁃3p 与PKM2 的靶向关系分析Fig.2 Analysis of the targeting relationship between miR⁃330⁃3p and PKM2

图4 miR⁃330⁃3p、PKM2 转染对胃癌细胞侵袭的影响Fig.4 The effect of miR⁃330⁃3p and PKM2 transfection on the invasion of gastric cancer cells

2.4 miR⁃330⁃3p、PKM2 转染对胃癌细胞增殖、侵袭、凋亡的影响与miR⁃NC 组比较，miR⁃330⁃3p⁃inhibitor 组miR⁃330⁃3p 表达量降低（P＜0.05），吸光度值、侵袭细胞数增多，凋亡细胞数减少（P＜0.05），下调miR⁃330⁃3p⁃inhibitor 组细胞PKM2 表达，吸光度值及侵袭细胞数均明显降低，凋亡细胞数增加（P＜0.05）。

图3 miR⁃330⁃3p 转染对胃癌细胞PKM2 表达的影响Fig.3 The effect of miR⁃330⁃3p transfection on the expression of PKM2 in gastric cancer cells

与miR⁃NC 组比较，miR⁃330⁃3p⁃mimcs 组miR⁃330⁃3p 表达量升高（P＜0.05），吸光度值、侵袭细胞数减少，凋亡细胞增加（P＜0.05）；上调miR⁃330⁃3p⁃mimcs 组细胞PKM2 表达，吸光度值及侵袭细胞数明显升高，凋亡细胞数减少（P＜0.05）。见表2、图4、图5。

表2 miR⁃330⁃3p、PKM2 转染对miR⁃330⁃3p 转染细胞增殖、侵袭、凋亡的影响Tab.2 Effects of miR⁃330⁃3p and PKM2 transfection on the proliferation,invasion and apoptosis of miR⁃330⁃3p transfected cells x±s

图5 miR⁃330⁃3p、PKM2 转染对胃癌细胞凋亡的影响Fig.5 Effects of miR⁃330⁃3p and PKM2 transfection on apoptosis of gastric cancer cells

2.5 miR⁃330⁃3p、PKM2 转染对miR⁃330⁃3p 转染细胞有氧糖酵解的影响miR⁃330⁃3p⁃inhibitor 组细胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、HK 活性、LDH 活性均显著高于miR⁃NC 组（P＜0.05）；下调miR⁃330⁃3p⁃inhibitor 组细胞PKM2 表达，细胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、HK 活性、LDH 活性等有氧糖酵解指标均明显降低（P＜0.05）；miR⁃330⁃3p⁃mimcs 组各有氧糖酵解指标显著低于miR⁃NC 组（P＜0.05），上调miR⁃330⁃3p⁃mimcs 组细胞PKM2 表达，有氧糖酵解指标均明显升高（P＜0.05）。见表3。

表3 miR⁃330⁃3p、PKM2 转染对miR⁃330⁃3p 转染细胞有氧糖酵解的影响Tab.3 Effects of miR⁃330⁃3p and PKM2 transfection on aerobic glycolysis of miR⁃330⁃3p transfected cells±s

表3 miR⁃330⁃3p、PKM2 转染对miR⁃330⁃3p 转染细胞有氧糖酵解的影响Tab.3 Effects of miR⁃330⁃3p and PKM2 transfection on aerobic glycolysis of miR⁃330⁃3p transfected cells±s

别细胞葡萄糖消耗量（mmol/L） 乳糖生成量（mmol/L）HK 活性（U/g）LDH 活性（U/g）iR⁃NC2.22±0.504.55±0.45160.12±22.7459.63±9.64 iR⁃330⁃3p⁃inhibitor3.11±0.626.85±0.56196.63±18.5274.15±10.22 iR⁃330⁃3p⁃inhibitor+PKM2⁃NC3.01±0.656.83±0.63189.63±22.1475.11±9.63组m m m miR⁃330⁃3p⁃inhibitor+PKM2⁃shRNA miR⁃NC miR⁃330⁃3p⁃mimcs miR⁃330⁃3p⁃mimcs+LV⁃NC miR⁃330⁃3p⁃mimcs+LV⁃PKM2 2.55±0.45 2.22±0.50 1.52±0.41 1.49±0.38 2.01±0.48 4.85±0.50 4.55±0.45 2.96±0.56 3.11±0.48 4.55±0.52 174.14±22.63 160.12±22.74 122.41±12.56 120.41±15.63 158.63±22.01 62.12±9.63 59.63±9.64 20.74±3.96 21.01±4.12 56.34±4.12

2.6 miR⁃330⁃3p、PKM2 转染对miR⁃330⁃3p 转染细胞凋亡、有氧糖酵解相关基因表达的影响与miR⁃NC 组比较，miR⁃330⁃3p⁃inhibitor 组PKM2、GLUT1、HK2 表达升高，促凋亡蛋白Bax、Caspase⁃3表达量降低（P＜0.05）；下调miR⁃330⁃3p⁃inhibitor组细胞PKM2 表达，Bax、Caspase⁃3 等蛋白表达明显升高，GLUT1、HK2 等蛋白明显降低（P＜0.05）。与miR⁃NC 组比较，miR⁃330⁃3p⁃mimcs 组PKM2、GLUT1、HK2 表达降低，Bax、Caspase⁃3 表达量明显升高（P＜0.05）；上调miR⁃330⁃3p⁃mimcs 组细胞PKM2 表达，Bax、Caspase⁃3 等蛋白表达明显降低，GLUT1、HK2 等蛋白明显升高（P＜0.05）。见表4、图6。

3 讨论

近年来的研究显示，miRNA可发挥转录调控作用影响肿瘤增殖、代谢及生物学行为，miRNA在肿瘤中的表达、致癌通路已成为当前研究的热点［10-11］。miR⁃330⁃3p 是一种被证实在多种恶性肿瘤中均存在表达降低的miRNA，既往国外开展的一项细胞及组织学研究显示，miR⁃300⁃3p 在胃癌细胞系及组织中表达下降，而miR⁃300⁃3p 过表达可促进E⁃钙黏蛋白的表达，抑制细胞的恶性生物学行为［12］；MA 等［13］近期开展的一项研究证实，过表达的miR⁃330⁃3p 可通过抑制Wnt/β⁃catenin 信号通路抑制细胞增殖及凋亡，有望成为胃癌的潜在治疗靶点。本研究结果显示，相比于正常胃粘膜上皮细胞，胃癌细胞系存在miR⁃330⁃3p 表达量的明显降低，构建miR⁃330⁃3p 低表达及过表达模型，结果显示，与对照组比较，miR⁃330⁃3p⁃inhibitor 组胃癌细胞增殖、侵袭作用增强，凋亡作用降低，而miR⁃330⁃3p⁃mimcs 组呈现相反趋势，提示抑制miR⁃330⁃3p 表达可促进胃癌细胞的恶性生物学行为，而过表达miR⁃330⁃3p则有一定抑制作用，提示miR⁃330⁃3p 的降低可能与胃癌的发生及发展密切相关，这一结果与既往研究报道类似［14-15］。当前miR⁃330⁃3p 对肿瘤生物学行为的具体调控机制仍未明确，目前认为，糖酵解过程在肿瘤生长、增殖、转移中均发挥重要作用，葡萄糖消耗及乳酸生成的增加是细胞糖酵解活动增强的重要指标［16-17］。本研究对胃癌细胞、miR⁃330⁃3p 低表达及过表达胃癌细胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、HK 活性、LDH 活性等糖酵解指标进行分析，结果显示，miR⁃330⁃3p 低表达细胞存在糖酵解指标的显著升高，而miR⁃330⁃3p⁃mimcs 组糖酵解指标显著降低，调控糖酵解相关基因表达也呈相同的趋势，提示miR⁃330⁃3p 或可通过作用于糖酵解作用影响胃癌细胞的生物学行为。

表4 miR⁃330⁃3p、PKM2 转染对凋亡、有氧糖酵解相关基因表达的影响Tab.4 Effects of miR⁃330⁃3p and PKM2 transfection on apoptosis and aerobic glycolysis⁃related gene expression

图6 miR⁃330⁃3p、PKM2 转染凋亡、有氧糖酵解相关基因表达的影响Fig.6 The effect of miR⁃330⁃3p and PKM2 transfection on apoptosis and aerobic glycolysis⁃related gene expression

PKM2 编码的丙酮酸激酶2 型是糖酵解过程中的关键酶，在多种恶性肿瘤中均存在过表达［18-20］，目前认为，PKM2 或可通过增强瓦伯格效应促进肿瘤细胞生长，肿瘤细胞中的高活性的PKM2 可快速供能，也可促进糖酵解中间产物进入旁路途径，通过一系列机制供应癌细胞物质促进其快速增殖［21］；研究证实PKM2 可与HIF⁃1 因子的亚单位共同影响肿瘤细胞代谢的改变［22］；WANG 等［23］开展的一项研究也表明，由EGFR 转位至细胞核中的PKM2 可促使钙黏蛋白转录增加，导致癌细胞的大量增殖。miR⁃330⁃3p 是否可通过靶向调控PKM2 影响糖酵解途径从而影响肿瘤细胞生物学行为仍有待研究探讨。为探讨miR⁃330⁃3p 与PKM2 的靶向作用，本研究采用生物信息学方法及荧光素酶报告系统分析两者的关系，结果显示，miR⁃330⁃3p 基因3’UTR 区域与PKM2 有结合位点，荧光素酶报告系统也提示miR⁃330⁃3p⁃mimcs 组PKM2 野生型荧光素酶活性降低，推测miR⁃330⁃3p与PKM2 可能具有一定靶向作用关系。为进一步确定miR⁃330⁃3p 通过靶向影响PKM2 表达从而影响胃癌细胞生物学行为，本研究在miR⁃330⁃3p 转染细胞中再分别上调或下调PKM2 表达，结果显示，下调miR⁃330⁃3p⁃inhibitor 组细胞PKM2 表达后，胃癌细胞增殖及侵袭行为均降低，凋亡升高，而上调miR⁃330⁃3p⁃mimcs 组细胞PKM2 表达后，胃癌细胞增殖及侵袭行为也明显升高，提示PKM2 的升高可回复miR⁃330⁃3p 升高对胃癌恶性生物学行为的抑制作用，而PKM2 的降低也可回复miR⁃330⁃3p 降低对胃癌恶性生物学行为的促进作用，两者存在靶向作用关系。

综上，miR⁃330⁃3p 表达与胃癌细胞增殖、凋亡及有氧糖酵解进程相关，其作用可能是通过靶向PKM2 实现，本研究的局限性在于未对PKM2 对胃癌细胞生物学行为的影响机制进行研究，拟在后续研究中探讨。