头颈部鳞癌顺铂耐药细胞系的建立以及顺铂耐药与Notch1的关系

盛李明 崔晓颖 程蕾 陈影 杜向慧

顺铂为基础的同步放化疗是局部晚期头颈部鳞癌的标准治疗方法，但由于患者对顺铂存在耐药现象，同步放化疗后的生存情况仍不理想，如何克服顺铂耐药是当前的研究热点之一，深入理解耐药机制是当前亟待解决的问题[1-2]。稳定的头颈部鳞癌顺铂耐药细胞系是研究耐药机制的主要对象，但目前尚缺乏成熟的顺铂耐药细胞系。本研究以头颈部鳞癌细胞系FaDu、UD-SCC-4及UM-SCC-22B为基础对象，采用顺铂浓度递增、间歇诱导的方法获取头颈部鳞癌顺铂耐药细胞系，鉴定顺铂耐药特性，同时探讨顺铂耐药与细胞表面受体编码基因Notch1表达的关系，以初步明确Notch1信号通路在头颈部鳞癌顺铂耐药过程中的作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 细胞系 人头颈部鳞癌细胞系FaDu购自美国ATCC公司，UD-SCC-4、UM-SCC-22B分别来自于德国Dusseldorlf大学和美国Michigan大学的头颈部鳞癌实验室。

1.2 主要药品和试剂 顺铂购自德国Sigma-Aldrich公司。MEM培养基和10% FBS均购自美国GIBCO公司，噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自美国 Roth公司，Notch1抗体购自美国Santa Cruz公司，内参蛋白Vinculin抗体购自英国Abcam公司，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，高纯RNA分离试剂盒购自美国Roch公司，First strand cDNA synthesis Omniscript RT试剂盒购自美国Qiagen公司。

1.3 头颈部鳞癌顺铂耐药细胞系的建立 将头颈部鳞癌细胞系FaDu、UD-SCC-4和UM-SCC-22B培养于含10% FBS的MEM培养基中，置于5% CO2、37℃、潮湿环境的培养箱中进行细胞培养。取对数生长期的鳞癌细胞，然后接种至含一定浓度顺铂的MEM培养基中处理2～4 h，弃上清液，加入新的MEM培养基，放回培养箱继续进行细胞培养，待其恢复至对数生长期时，重复上述操作，但顺铂的浓度逐渐增加，历时4～9个月（各细胞系需要的顺铂浓度和时间均不一样）。经多次MTT检测，成功获取相应的头颈部鳞癌顺铂耐药细胞系FaDuDDP-R、UD-SCC-4DDP-R和 UM-SCC-22BDDP-R。

1.4 顺铂耐药细胞系耐药指数的测定 采用MTT法。使用0.25%胰酶消化处于对数生长期的鳞癌细胞并制作成单细胞悬液，然后接种于96孔板24 h，每孔250个细胞，每组设6个复孔，待细胞贴壁，使用含不同浓度顺铂的MEM培养基处理细胞7～10 d，待未经顺铂处理的细胞贴壁密度为70%～85%时终止培养，每孔加入20 μl MTT溶液，放回培养箱孵育1 h，弃培养基；每孔加入二甲基亚砜150 μl，振荡10min。使用酶标仪于检测每孔540 nm处的吸光度值（A），计算细胞存活率；细胞存活率=（A处理组/A对照组）×100%。重复上述试验3次，计算顺铂半数抑制药物浓度（IC50），计算耐药细胞系的耐药指数；耐药细胞系的耐药指数=耐药细胞系IC50/原细胞系IC50。

1.5 原鳞癌细胞系及其耐药细胞系Notch1蛋白表达检测 采用Western blot法。取对数生长期的鳞癌细胞，使用RIPA裂解液进行细胞裂解，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，然后将相同质量的蛋白加入到8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）中。每孔加入50 μg蛋白样本，恒压电泳，然后将SDSPAGE凝胶恒流转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，使用5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h，洗膜后加入一抗（Anti-Notch1，1∶1 000），置于 4 ℃冰箱过夜。使用 1×TBST 缓冲液洗膜3次，10 min/次；加入1∶15 000稀释于5%脱脂奶粉中的辣根过氧化物酶标记的二抗，在室温下孵育1 h；再次使用 1×TBST缓冲液洗膜 3次，10 min/次；1×TBS缓冲液洗膜10 min。采用ECL plus化学发光法进行显色，使用Fuji X线片曝光蛋白信号。

1.6 原鳞癌细胞系及其耐药细胞系Notch1 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。使用高纯RNA分离试剂盒提取RNA，使用Nanophotometer仪检测其浓度及纯度；使用First strand cDNA synthesis Omniscript RT试剂盒逆转录成cDNA；根据Genebank上的NOTCH1基因序列在UPL probe上设计目的基因及内参基因（β-tubulin）的引物。NOTCH1基因上游引物：5′-CAGCCAGTGCAACTCAAGC-3′，下游引物：5′-TCCTTGCAGTACTGGTCGTACA-3′；β -tubulin 上 游 引 物 ：5′-CCCCTTCAAGTTCTAGTCTGC-3′，下游引物：5′-GCATTGCCAATCTGGACAC-3′。使用Light Cycler仪进行qRTPCR，反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共50个循环。每个样本重复3次，每次设3个复孔。采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量，其中Ct值为荧光信号达到阈值所经历的循环数。

1.7 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 顺铂耐药细胞系的耐药指数 不同浓度顺铂处理头颈部鳞癌细胞系及其顺铂耐药细胞系后细胞存活率见图1；头颈部鳞癌细胞系及其顺铂耐药细胞系对顺铂的 IC50见表 1。FaDuDDP-R、UD-SCC-4DDP-R和 UM-SCC-22BDDP-R对顺铂的耐药指数分别为5.72±0.39、7.41±1.19和 3.29±0.16。

2.2 头颈部鳞癌细胞系及其顺铂耐药细胞系Notch1蛋白表达比较 FaDuDDP-R、UD-SCC-4DDP-R的F-Notch1及活化的C-Notch1蛋白表达均高于原鳞癌细胞系；而UM-SCC-22B及其耐药细胞系上未见Notch1蛋白表达，见图2。

图 1 不同浓度顺铂处理头颈部鳞癌细胞系及其顺铂耐药细胞系后细胞存活率（a：FaDu；b：FaDuDDP-R；c：UD-SCC-4；d：UD-SCC-4DDP-R；e：UM-SCC-22B；f：UM-SCC-22BDDP-R）

表1头颈部鳞癌细胞系及其顺铂耐药细胞系对顺铂的IC50（mg/L）

2.3 头颈部鳞癌细胞系及其顺铂耐药细胞系Notch1 mRNA相对表达量比较 与原鳞癌细胞系比较，UDSCC-4DDP-R的Notch1 mRNA相对表达量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而 FaDuDDP-R与 FaDu、UD-SCC-4DDP-R与UM-SCC-22B的Notch1 mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

图2 头颈部鳞癌细胞系及其顺铂耐药细胞系Notch1蛋白表达的电泳图

3 讨论

以顺铂为基础的同步放化疗及辅助治疗，能够有效地提高头颈部鳞癌患者的局部控制率，减少远处转移[3]；同时能更好地保留头颈部重要器官功能[4]。2009年一项基于93项随机对照试验的Meta分析结果显示，与单纯放疗比较，局部晚期头颈部鳞癌患者行序贯化疗能将5年生存率提高4.5%，同步化疗则能提高6.5%，提示患者更能从以顺铂为基础的化疗中获益[5]。顺铂虽然是局部晚期头颈部鳞癌一线治疗方案的首选药物，但由于其耐药现象的存在，一线方案治疗效果仍较差。如何克服顺铂耐药现象，不仅对头颈部鳞癌的意义重大，对肺癌、食管癌、宫颈癌等使用顺铂化疗的癌种也意义重大。目前尚缺乏成熟、稳定的头颈部鳞癌顺铂耐药细胞系，本研究通过顺铂浓度递增、间歇诱导的方法建立了3种头颈部鳞癌顺铂耐药细胞株，并经MTT法检测发现这3种耐药细胞系对顺铂的耐药指数高于原头颈部鳞癌细胞系，其中UD-SCC-4DDP-R的耐药指数最高，是以后研究顺铂耐药的最佳研究模型。

表2 头颈部鳞癌细胞系及其顺铂耐药细胞系Notch1 mRNA相对表达量比较

Notch信号通路是一类高度进化保守的信号通路，在多能祖细胞发育、组织更新及干细胞分化中起着重要作用[6]。目前发现哺乳动物中有4种Notch（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）受体及 5 种配体（Jag1、Jag2、Dll 1、Dll 13、Dll 14等）。顺铂耐药细胞系的Notch1蛋白表达较原头颈部鳞癌细胞系明显升高，表明Notch1蛋白过表达与头颈部鳞癌顺铂耐药现象有关。Notch1过表达后，可通过γ-enolase途径增加c-myc的活性，从而诱导顺铂耐药的发生[7-11]。体外研究发现，γ-分泌酶抑制剂能够通过抑制Notch1蛋白活性来增加顺铂治疗的敏感性[12]。临床研究也发现，Notch1过表达患者使用顺铂化疗后，易出现早期治疗失败[13]。以上研究结果均表明Notch1在头颈部鳞癌上表现出癌基因的特点。在本研究中，Notch1蛋白及mRNA表达在UD-SCC-4及其顺铂耐药细胞株上存在一致性，这与Krikelis等[14]研究结果一致；但在FaDu及其耐药细胞株上两者表达不一致，这与既往关于喉癌细胞株的一项研究结果类似[15]。虽然FaDu和UD-SCC-4同属于头颈部鳞癌，但是FaDu细胞来源于喉咽癌，而UD-SCC-4细胞来源于口咽癌，组织来源上的差异可能导致了蛋白及mRNA表达的不一致。

综上所述，本研究初步建立了3种头颈部鳞癌顺铂耐药细胞系（FaDuDDP-R、UD-SCC-4DDP-R和UM-SCC-22BDDP-R），均有顺铂耐药的生物学特性，且与Notch1表达有关。