淫羊藿苷对维甲酸致骨质疏松模型大鼠骨钙素mRNA及蛋白表达的影响

李 文，王宗陵，李 倩，张孟之，龚华乾，吴雍真，周 艳，陈云志，柴艺汇，*

1.贵州中医药大学(贵州 贵阳 550025)

2.兴义市人民医院(贵州 兴义 562400)

骨质疏松(osteoporosis,OP)是以骨量低下以及骨微观结构损坏，导致骨脆性增加，从而易发生骨折系统性骨代谢紊乱疾病。患者常见症状为腰痛甚至全身疼痛，当负重增加时更疼痛难当、活动受限。OP危害中老年人的身体健康和生活质量，已成为严重的公共健康问题[1]。目前OP的治疗以西药为主，恰当的使用在短期内有一定的疗效，但长期疗效不理想，若使用不当还存在一定毒副作用[2]。中医学将OP归属于“骨痿”“骨枯”等病证，多与肾虚有关，而补肾类中药淫羊藿中的有效活性成分淫羊藿苷(icariin，ICA)可通过多种途径改善OP患者病理状态，具有增强成骨细胞活性、抑制破骨细胞分化、减少骨吸收的陷窝数进而改善骨组织结构[3]。本实验拟以ICA干预治疗维甲酸造模构建OP大鼠模型，初步揭示ICA抗OP的作用机制[3]，为进一步研究淫羊藿有效防治OP提供实验基础及依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及主要仪器48只8周龄SPF级SD雌性大鼠，均购自长沙市天勤生物技术有限公司，体质量(190±20)g，动物许可证号：SCXK(湘)2014-0011。RM 2016轮转式切片机(德国Leica公司)；BX53型生物显微镜(奥林巴斯公司)，MK-3酶标仪(Thermo公司)；5810R型台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；实时荧光定量PCR仪(ABI，QuantStuDio 6)；电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-7C)。

1.2药物与试剂ICA(南京泽朗医药科技有限公司生产，批号：489-32 -7)；骨化三醇(青岛正大海尔制药有限公司生产，批号：国药准字H200030491)；维甲酸(西安绿腾生物科技有限责任公司生产，批号：LT2018030201)；大鼠骨钙素骨谷氨酸蛋白OC ELISA试剂盒(武汉华美有限公司，批号：CSB-E05129r)；免多抗GAPDH(37KD)(杭州贤至生物有限001公司，AB-P-R)；兔多抗0C(11KD)(北京博奥森生物技术有限公司，Bs-4917R)。

1.3实验方法

1.3.1 分组与造模 将48只8周龄雌性SD大鼠，随机分为空白对照组、模型组、维生素D组、ICA高剂量组、ICA中剂量组、ICA低剂量组，每组8只，并用苦味酸进行色彩标记，适应性喂养1周后称重。对照组给予生理盐水[8 mL/(kg·d)]灌胃，其余大鼠按照100 mg/(kg·d)，用药体积8 mL/(kg·d)给予维甲酸灌服2周构建OP模型，以宏观疾病证候特征(大鼠行为学改变)和微观生物学指标作为模型评价的依据。

1.3.2 实验给药 造模结束后，空白对照组灌胃生理盐水[8 mL/(kg·d)]，模型组灌胃维甲酸[8 mL/(kg·d)]，维生素D组给予灌胃骨化三醇30 ng/(kg·d)，ICA高剂量组给予灌胃ICA 120 mg/(kg·d)、ICA中剂量组给予灌胃ICA 60 mg/(kg·d)，ICA低剂量组给予灌胃ICA30 mg/(kg·d)，均为1次/d，连续干预治疗42 d。实验结束后，麻醉无痛条件腹主动脉取血，静置于分离胶-促凝管中30 min后，4℃低温离心，-80℃备存。摘取右侧后腿股骨浸置于4%的多聚甲醛固定液内4℃充分固定24 h以上。将左侧后腿股骨组织冰冻保存备用。

1.4检测指标摘取的右侧后腿股骨标本经HE染色，镜检观察病理改变。 ELISA法检测ICA大鼠血清骨钙素(OC)含量的影，RT-PCR检测OP大鼠左侧后腿股骨OCmRNA的影响，严格按照Western blot操作步骤行大鼠左侧后腿股骨OC蛋白表达的测量。

2 结果

2.1行为学观察灌服维甲酸2周后，大鼠饮食饮水明显减少并出现便溏、体质量下降，背毛光泽度较暗且凌乱倒刺、活动度明显下降、喜卧、弓背移动；在进行ICA干预后，大鼠的精神状态改善，排泄物对比之前稍干燥、弓背缓解，饮食饮水量及自主活动度明显提高，体质量增加。

2.2 HE染色病理观察空白对照组可见骨小梁较多、体积较大、分布均匀，有丰富的血窦；维甲酸模型组骨小梁变少、变细、分布稀疏，骨小梁之间连接的游离端明显增多，呈松散状态，网状结构被破坏，骨细胞坏死，破骨细胞核染深、胞体大；与模型组比较，ICA高、中剂量组及维生素D阳性药对照组中，网状结构部分恢复，出现较为完整连续的骨组织，骨小梁变多、变粗，成骨细胞增多，骨髓腔变小且规则分布。与空白对照组比较，模型组骨小梁变薄、变细、结构断裂，破骨细胞明显增多且功能活跃，骨髓腔内面积增加，较为“空旷”。模型组大鼠右侧后腿股骨皮质骨面积有减少趋势，见图1。

2.3 ICA对维甲酸诱导的OP大鼠血清OC的影响与空白对照组比较，模型组的OC水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，ICA各剂量组OC水平较低(P<0.05)；与模型组比较，维生素D组的OC水平显著降低(P<0.01)，见表1。

表1 ELISA检测药物干预后大鼠血清OC含量

2.4 ICA对维甲酸诱导的OP大鼠左侧后腿股骨OC mRNA的影响与空白对照组相比，模型组骨骼OC mRNA的表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，各药物干预组的骨骼OC mRNA表达均显著下调(P<0.01)，见表2。

表2 RT-qPCR检测药物干预后大鼠骨骼OC mRNA表达

2.5 ICA对维甲酸诱导的OP大鼠左侧后腿股骨OC蛋白表达的影响与空白对照组相比，模型组的骨骼OC蛋白表达显著上调(P<0.01)。与模型组相比，ICA高、中剂量组和维生素D组的骨骼OC蛋白表达均显著下调(P<0.01)，见表3，图2。

表3 Western blot检测干预后大鼠骨骼OC蛋白表达

注：A：对照组；B：模型组；C：维生素D组；D：ICA高剂量组；E：ICA中剂量组；F：ICA低剂量组。

3 讨论

骨骼的不同部分由不同的形状组成，但其内部结构大多具有相似层次结构，主要包括I型胶原的三股螺旋结构、非胶原蛋白及沉积于其中的羟基磷灰石结构[4]。骨骼的完整性由机体内连续且重复的成骨和破骨两个过程维持，此过程称为“骨重建”[5]。一般来说，每年大约更换3%的骨皮质、25%的骨小梁；成年期后，骨吸收率大于骨形成率并逐渐开始出现负平衡，年龄越大骨量丢失情况将愈发严重[6]。OP是以骨组织损伤为特征的全身性骨代谢异常疾病。随着OP发病的绝对人数明显升高，寻求安全高效的药物改善其症状成为亟待解决的问题。OC是一种特定的非胶原基质蛋白，由非增殖成骨细胞合成和分泌，是表现成骨细胞功能中较为敏感的指标，在高转化率的代谢性骨病中发挥重要作用[7]。目前，成熟OC主要沉积在骨组织和牙本质的细胞外基质中，一小部分释放到血液循环中[8]；抗骨吸收药物可降低OC水平，动物实验显示，维生素D缺乏的OP大鼠给予纠正OC等异常表达后可有效缓解OP的症状[9]。细胞实验发现[10]在成骨细胞分化、基质矿化以及骨吸收中，OC可直接反映骨转换状态，表明骨正在经历形成与吸收结合状态。OP临床表现与OC的变化密切相关[11]。临床研究中，血清OC水平与年龄呈负相关，但对于绝经后妇女，由于骨转换加速，OC升高到一个峰值；随着步入老年，OC逐渐减少[12]。绝经后女性OC水平显著高于男性，卵巢的功能衰退伴随雌激素的急剧下降，OC增加致使未形成足量骨基质，影响钙盐沉着[13]。破骨细胞被刺激，数量增多，骨转换率升高，骨吸收大于骨形成，使得细胞外的OC的含量升高。

中医学《扁鹊心书》认为：随年岁增加肾气虚、肾水竭，而发展为“骨缩病”，其表现与现代医学之OP类似[14]，故根据OP的临床表现将其归属于“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范畴。黄元御谓淫羊藿：“荣筋强骨，起痿壮阳，滋益精血，温补肝肾，治阳痿不举……起瘫痪，清风明目，益志宁神。”由此可见，淫羊藿既补阳气又益阴精，药效之间相辅相成，恰中骨质疏松“肾精不足”的病机。现代医学也汲取了古代医学的治疗经验，开展淫羊藿相关临床及动物实验证实，淫羊霍除了发挥雌激素样作用，还可促进肠钙及尿钙的重吸收，进而防止骨量丢失[15]；广泛应用于骨骼类疾病的仙灵骨葆胶囊，其主要成分为淫羊藿，能显著改善OP患者骨密度状况，并能显著升高血清OC水平[16]。淫羊藿中主要活性成分ICA可提高血清OC含量、维持骨的矿化率、抑制软骨的矿化[17]。由此可见，补肾中药淫羊藿具有多成分、多靶点的特点，无论辩证与否，均可作为治疗OP的治疗药物之一。

本组结果表明，相对于模型组，ICA高剂量组OC水平较低，维生素D组的OC水平显著降低；检测大鼠骨RT-qPCR结果提示，与模型组比较，各药物干预组的骨骼OC mRNA表达均显著下降；大鼠左侧后腿股骨Western blot结果显示，与模型组相比，ICA高、中剂量组和维生素D组的骨骼OC蛋白表达均显著下调。综上，ICA可通过调节维甲酸所致OP模型大鼠骨骼中OC mRNA和蛋白水平，从而达到防治OP的目的，为进一步研究ICA治疗OP的分子机制提供实验依据，也为中医药防治OP提供研究思路。