成熟过程对红曲霉干酪中生物胺的影响及其安全性评估

刘 景，刘振民*

（乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436）

生物胺是一类具有一定生物活性的低分子质量含氮化合物的总称，但人体摄入过量时则会产生头痛、恶心、血压波动、呼吸困难等多种过敏性反应。天然干酪中的生物胺主要由蛋白质水解生成的游离氨基酸为底物、经特定的酶脱羧产生[1]。生物胺普遍存在于多种食品中，如水产品、发酵酒、乳制品、肉类、蔬果等。乳制品中以干酪中生物胺最为典型。干酪中常见生物胺有组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、β-苯乙胺、精胺、亚精胺8 种[2]。就组胺来说，干酪中的含量仅次于以鱼类为代表的水产品[3]。因此，食品中天然产生的生物胺是食品安全关注重点之一。

目前，国际上对食品中的生物胺尚无统一限量标准，各国分别依据本国的法律法规制定标准。例如，美国食品药品监督管理局将金枪鱼等鱼类中组胺的安全阈值设定为50 mg/kg，而酪胺和苯乙胺的安全阈值则分别为100～800 mg/kg和30 mg/kg[4]。印度规定生鲜和即食鱼产品中组胺可接受限量为100 mg/kg，最大残留量为200 mg/kg；而干制和发酵鱼制品中上述限量值分别为200 mg/kg和400 mg/kg[5]。我国则在地方标准中规定发酵肉制品中组胺含量不高于100 mg/kg[6]。

霉菌成熟干酪是一类以霉菌作为发酵剂生产的干酪，目前使用较多的霉菌发酵剂主要为卡地干酪青霉（Penicillium camemberti）、娄地青霉（Penicillium roqueforti）和白地霉（Geotrichum candidum），常见的霉菌干酪主要有蓝纹干酪、卡门贝尔干酪和布里干酪等[7]。红曲霉是中国传统食物红腐乳、红曲米、红曲酒等的主要霉菌发酵原料。红曲霉作为干酪霉菌发酵剂不仅风味、色泽易于被大多数国人接受，是霉菌干酪进入大众消费领域的良好媒介，而且红曲霉发酵产物被证实含有多种有益人体的活性物质，如洛伐他汀、γ-氨基丁酸、麦角固醇等，具有良好的营养附加值。因此，近年来许多研究尝试使用红曲霉制作霉菌干酪[8-9]。但这些研究集中于将红曲霉应用于干酪的工艺和制作方法以及红曲霉对干酪质构和风味产生的影响，对食品安全，尤其是红曲霉干酪中生物胺的影响研究还很少。

本研究以生乳为主要原料，在霉菌干酪加工工艺的基础上，使用红曲霉作为霉菌发酵剂，制作红曲霉干酪，研究红曲霉干酪成熟过程中，不同的成熟条件对产生的生物胺种类及含量的影响，并在此基础上开展对红曲霉干酪中生物胺摄入的初步安全评估。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生乳取自光明金山牧场。

乳酸菌发酵剂YO-MIX 900 科汉森（中国）有限公司；凝乳酶Marzyme 150MG 丹尼斯克（中国）有限公司；红曲霉菌种（编号GM1809，来源于腐乳）为自行保藏菌株；组胺、色胺、β-苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、亚精胺、精胺标准品（均为色谱纯） 美国Sigma公司；丹磺酰氯、碳酸钠、碳酸氢钠、甲醇、丙酮、正庚烷（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

精密天平 德国Santorius公司；1260高效液相色谱仪、Zorbax Eclipse XDB-C18高效液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美国Agilent公司；干酪槽、模具等为自制。

1.3 方法

1.3.1 红曲霉干酪加工工艺

生牛乳→标准化（蛋白质含量3.1 g/100 mL）→巴氏杀菌（72 ℃、20 s）→冷却（37 ℃）→接种乳酸菌发酵剂（1 g/100 L）→添加霉菌发酵液（体积比3%）→发酵（34 ℃、1.5 h）→加凝乳酶（40 IMCU/L）→切割→搅拌→入模排乳清→18 h后脱模→盐浸（17 g/100 mL NaCl溶液，2 h）→成熟（10～20 ℃、25 d，相对湿度95%）→包装→4 ℃存放

其中，成熟过程需要注意环境清洁，前72 h内每隔24 h翻转通风，后期2～3 d翻转1 次。在10、14、20 ℃ 3 个不同温度成熟条件下分别检测红曲霉干酪中的生物胺含量，测定时间节点为0、3、7、14、21、25 d。

1.3.2 红曲霉干酪中生物胺的测定

预处理及衍生化：取5 g红曲霉干酪样品（称质量前整块搅碎并混合均匀），加入15 mL 0.6 mol/L高氯酸溶液混匀，振荡30 min后2 000×g离心10min，取上清液；按以上步骤使用高氯酸提取样品3 次，合并上清液并过滤至容量瓶；用0.6 mol/L高氯酸溶液将滤液定容至50 mL，摇匀取0.5 mL样液，加入1.5 mL碳酸盐缓冲液（NaH2PO4·2H2O-Na2HPO4·2H2O，pH 10.0）和2 mL 7.5 g/L丹磺酰氯溶液（溶剂为丙酮），60 ℃反应45 min后，40 ℃氮吹除去丙酮溶剂，加入3 mL正庚烷萃取，吸取上清液，氮气吹干后加入1 mL甲醇完全溶解，经0.45 μm滤膜过滤后待测。

高效液相色谱测定：参照刘景等[10]的方法，使用高效液相C18反相色谱分离衍生化样品，衍生化试剂为丹磺酰氯，计算生物胺含量。

1.3.3 红曲霉干酪中生物胺的安全评估

本研究采用非参数概率评估模型（式（1））评估红曲霉干酪中生物胺的风险[11]。

式中：y为红曲霉干酪中生物胺暴露量/（μg/（kg·d））；p为生物胺的种类数；x为膳食调查中干酪的消费量/（g/d）；c为红曲霉干酪中生物胺的检测值/（mg/kg）；m为人群体质量/kg。其中，膳食调查干酪消费量数据来自乳制品消费调查资料[12-14]，人群体质量数据来自中国居民营养与健康调查系列报告[15-16]。

分别将x和c作为2 个独立分布的总体，获得特定的分布特征和参数，在这2 个总体中进行随机抽样并配对相乘，并使用m进行校正，从而获得y的概率分布。该模型的变异程度使用暴露量分布的特征统计量（如平均值等）和百分位点值表示。

健康指导值的设定能为风险管理者提供风险评估的定量信息，从而做出保护人类健康的决策。根据健康的剂量-反应关系，摄入50 mg生物胺并不会引起毒性反应。当摄入75 mg及以上生物胺时，可能导致充血、腹泻、头痛等症状[17-19]。因此，本研究以安全阈值较低的50 mg作为无毒性参考剂量（reference no toxicological dose，RFNTD）。使用健康指导值安全日摄入量（safe daily intake，SDI），根据定量风险评估结果给出建议摄入范围。

中国人群建议的红曲霉干酪SDI按式（2）计算。

式中：c为红曲霉干酪中生物胺含量/（mg/kg）。

1.4 数据处理

使用@Risk 7.0软件（Palisade公司）的Monte-Carlo模拟，在式（1）中2 个独立分布总体中进行随机抽样，并配对运算，得到概率分布。

2 结果与分析

2.1 成熟时间对红曲霉干酪中生物胺含量的影响

图 1 成熟时间对红曲霉干酪生物胺含量的影响Fig. 1 Influence of ripening time on biogenic amines contents in Monascus-fermented cheese

由图1可知，随着成熟时间的延长，红曲霉干酪中生物胺含量的变化存在以下特点：红曲霉干酪中的生物胺为β-苯乙胺和酪胺，其他生物胺均未检出，其中酪胺在成熟前期（＞3 d）出现，β-苯乙胺在成熟后期（＞14 d）出现，酪胺和β-苯乙胺可能是红曲霉干酪中的典型生物胺；总生物胺含量随着成熟时间延长而不断增加，成熟14 d后，由于β-苯乙胺的出现增加更为快速，14 d的成熟时间可能是红曲霉干酪生物胺控制的关键节点。由于苯乙胺的毒性阈值较酪胺更低[17]，因此，生产中应尽量避免β-苯乙胺的生成，在风味、质地等满足质量要求的前提下，红曲霉干酪成熟时间应尽量缩短。

2.2 成熟温度对红曲霉干酪中生物胺含量的影响

表 1 不同成熟条件下红曲霉干酪中生物胺含量Table 1 Concentrations of biogenic amines in Monascus-fermented cheese under different ripening conditions

由表1可知：成熟温度较低（10～14 ℃）时，红曲霉干酪中的生物胺为β-苯乙胺和酪胺，且这2 种生物胺含量均随成熟时间的延长而增加，其中酪胺含量高于β-苯乙胺；成熟温度较高（20 ℃）时，除了β-苯乙胺和酪胺之外，组胺也开始生成，但含量低于前两者。值得注意的是，当成熟温度上升时，3 种生物胺的增长均较为快速，出现的时间点也提前。其中，酪胺生成较β-苯乙胺和组胺更多、含量增加更为迅速，出现也相对最早（成熟温度10 ℃，成熟时间＞7 d）。

由于成熟时间会影响干酪风味物质的形成[18,20]，因此在风味、质地区别不大的前提下，红曲霉干酪的成熟时间为14～21 d，有利于避免产生较高含量的生物胺。本研究在全面考察风味、质地、生物胺等因素后，将红曲霉干酪的成熟条件定为14 ℃、12～14 d。

2.3 红曲霉干酪中生物胺的安全摄入评估

按以上成熟条件制作9 批红曲霉干酪，并检测其中的生物胺含量。使用1.3.3节方法评估红曲霉干酪中生物胺在中国人群中的安全性。

由表2可知，当红曲霉干酪中生物胺的暴露量为49.42 μg/（kg·d）时，97.5%人群具有暴露风险；而暴露量升高到94.72μg/（kg·d）时，则99%的人群处于暴露风险中。

表 2 中国人群对红曲霉干酪中生物胺的暴露评估结果Table 2 Exposure assessment to biogenic amines in Monascusfermented cheese in Chinese population

表 3 中国人群对红曲霉干酪的SDITable 3 SDI of Monascus-fermented cheese in Chinese population

对中国地区人群来说，针对经由膳食暴露的红曲霉干酪中生物胺而引发的食品安全风险。由表3可知，为保证99.9%人群的红曲霉干酪生物胺暴露安全，建议人均红曲霉干酪摄入量不超过58 g/d。

3 结 论

红曲霉干酪是一种以中国传统食品原料红曲作为霉菌发酵剂制成的新型干酪。本研究对红曲霉干酪中生物胺的种类、数量、在成熟过程中的变化及其安全性评估作了较为系统的研究。

红曲霉干酪中生物胺含量随成熟时间的延长、温度的增加呈增加趋势，酪胺、β-苯乙胺和组胺是其中检出的3 种典型生物胺。β-苯乙胺多出现在成熟后期（＞7 d），组胺出现在成熟温度较高（＞14 ℃）的条件下，相比之下，酪胺的含量和增长速率均高于其他2 种生物胺，出现时间也最早。在红曲霉干酪实际生产中，为减少生物胺的生成同时保证良好风味和质构特性，成熟条件应在温度和时间2 个重要影响因素中选择适当的平衡点。本研究表明，成熟温度14 ℃、成熟时间12～14 d是红曲霉干酪较为适宜的成熟条件。

以红曲霉干酪生物胺含量检测数据、膳食调查和人群体质量为基础的红曲霉干酪生物胺暴露评估结果表明，中国人群红曲霉干酪生物胺暴露平均值为8.55 μg/（kg·d），P99百分位值为94.72 μg/（kg·d），以该暴露评估结果为基础得到中国人群红曲霉干酪的健康指导值。为保证99.9%人群的红曲霉干酪生物胺暴露安全，建议人均红曲霉干酪摄入量不超过58 g/d。