婴幼儿配方乳粉中甲醛含量测定及暴露污染评估

陈同强，荆辉华，彭国泰，易守福，徐文泱，王亮亮，李凯龙，李 灿，向 礼,*

（1.食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南 长沙 410111；2.湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410000；3.湖南省植物保护研究所，湖南 长沙 410125）

甲醛是一种无色有刺激性气体，同时也是一种常见的食品有机污染物。甲醛的主要危害为对皮肤黏膜的刺激作用，严重时可引起呼吸困难、肺水肿等症状[1-2]，长期接触甚至可能引发白血病等疾病[3]。近年来，大量调查研究显示诸多食品中检出甲醛，如水产品、香菇等农产品，然而大部分食品中的甲醛并非人为添加或因环境污染导致，而是在其生长、贮藏和加工过程自然产生[4-5]。婴幼儿配方乳粉作为一类特殊食品，在日常检验工作中发现其中甲醛的检出率处于较高水平，有研究称可能是婴幼儿配方乳粉在高温条件下，加上其中某些营养强化剂的促进而生成甲醛[6-7]。乳粉中甲醛的残留可能会给婴幼儿健康带来风险，目前因缺乏足够的实验数据及膳食数据的支持，我国尚未对婴幼儿配方乳粉中甲醛作限量要求。

食品中甲醛存在形式除了游离态，还有结合态，如蛋白质易与甲醛结合形成甲醛-蛋白质复合物，葡萄酒中甲醛常以与SO2结合的形式存在等。结合态的甲醛又分为可逆与不可逆2 种结合方式。

目前国内外对于甲醛的检测方法较多，大多采用光谱法[8-10]、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[11-13]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[14-17]等这些方法检出限往往较高且容易受到干扰，HPLC法与GC-MS法虽相对准确，但对前处理要求很高，回收率较低，因此，难以适应基质本身较为复杂的婴幼儿配方乳粉中微量甲醛的测定。本研究优化一种GC法对婴幼儿配方乳粉中甲醛进行定性及定量测定，同时采用GC-MS确证。在不同水温下冲调乳粉，分别对其中的甲醛含量进行检测，比较不同水温冲调对乳粉中甲醛含量的影响，同时对网购45 份婴幼儿配方乳粉的甲醛污染水平进行调查分析与风险暴露评估，为生产企业保障产品质量安全和政府部门制定婴幼儿配方乳粉中甲醛的限量提供一定的数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

婴幼儿配方乳粉45 份（网购，国产品牌20 份，国外品牌25 份），0～6 月龄、6～12 月龄、12～36 月龄各15 份。

甲醛标准溶液（100 mg/L） 国家标准物质中心；2,4-二硝基苯肼（分析纯）、乙腈（色谱纯）、环己烷（色谱纯） 阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A气相色谱仪（配备电子捕获检测器（electron capture detector，ECD））、HP-5毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、7890B-5977B气相色谱-质谱仪、DB-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 标准反应液制备

衍生液的配制：称取适量2,4-二硝基苯肼，用乙腈配制成质量浓度为0.5 g/L的溶液，再与磷酸盐缓冲溶液（pH 5）按体积比1∶1混合即得。

分别移取0.00、0.01、0.02、0.05、0.08、0.10 mL甲醛标准溶液，置于50 mL塑料离心管中，分别加入10.0 mL衍生液，摇匀，于60 ℃水浴中反应1 h，取出冷却后，加入4～5 g硫酸铵固体，混匀，静置5 min，向标准反应液中加入5.0 mL环己烷，涡旋1 min后，5 000 r/min离心5 min，分层，得到不同甲醛质量浓度的标准衍生溶液，取上清液，加入5 g无水硫酸钠处理，供GC分析。

1.3.2 样品反应液制备

称取乳粉样品2.0 g左右于50 mL塑料离心管中，加入10.0 mL衍生液，涡旋混匀，60 ℃水浴振摇1 h，取出后冷却至室温，加入4～5 g硫酸铵固体，混匀，静置5 min，加入5.0 mL环己烷，涡旋1 min后，5 000 r/min离心5 min，分层，取上清液，加入5 g无水硫酸钠处理，供GC及GC-MS分析。

1.3.3 GC条件

进样口温度250 ℃，流速1.0 mL/min，进样量1 mL，不分流进样；升温程序：初始温度40 ℃，以20 ℃/min的速率升温至240 ℃并保持2 min；ECD检测器温度300 ℃。

1.3.4 GC-MS条件

进样口温度250 ℃，流速1.0 mL/min，进样量1 mL，不分流进样；升温程序：初始温度60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升温至180 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升温至280 ℃，保持5 min；离子源温度230 ℃；电离方式：电子轰击；确证方式：全扫描与选择离子监测模式。

1.3.5 不同冲调温度对乳粉中甲醛含量的影响

随机选取其中1 份乳粉样品，按照标签说明，称取样品30.0 g（约7 平勺），共6 份，每份分别采用30、40、50、60、70、80 ℃的水200 mL进行冲调，密封，待冷却后，称取10.0 g，甲醛含量检测过程同1.3.2节。

1.3.6 甲醛的暴露量计算

甲醛含量按式（1）计算。

式中：C为乳粉中甲醛含量/（mg/kg）；m1为从标准工作曲线得到的样液中甲醛质量/μg；m为乳粉质量/g。

甲醛暴露量按式（2）计算。

式中：I为甲醛暴露量/（μg/kg）；C为乳粉中甲醛含量/（mg/kg）；m2为乳粉日摄入量/g；m3为婴幼儿体质量/kg。

不同月龄婴幼儿体质量和婴幼儿配方乳粉日摄入量参考值如表1所示。

表 1 不同月龄婴幼儿体质量和婴幼儿配方乳粉日摄入量Table 1 Body mass and daily intake of infant formula in infants of different ages

1.4 数据处理

数据处理及绘图采用Excel 2010软件完成。

2 结果与分析

2.1 样品提取方法选择

乳粉中甲醛主要为游离态甲醛和以蛋白质-甲醛复合物形式存在的结合态甲醛，内源性甲醛主要生成途径有糖和氨基酸的美拉德反应[9]。将乳粉样品分别经常见的水浸法、水蒸气蒸馏法和衍生液提取法3 种方法提取。

表 2 不同提取方法对婴幼儿配方乳粉中甲醛含量测定结果的影响Table 2 Effect of different extraction methods on formaldehyde determination in infant formula

由表2可知，水浸法仅能提取到乳粉中游离甲醛，甲醛含量测定结果远低于其他2 种提取方法，因此不适合乳粉样品的前处理。水蒸气蒸馏法和衍生液提取法测得甲醛含量相近，且均远高于水浸法提取甲醛含量，表明该2 种方法均能提取乳粉中游离甲醛和可逆结合态甲醛。水蒸气蒸馏法的检测结果略高于衍生液提取法，原因可能为蒸馏过程导致乳粉颜色变深，发生美拉德反应，生成了内源性甲醛[9]。日常检验数据显示乳粉样品中甲醛含量一般相对较低，且乳粉属于复杂基质样品，如果提取方法不当，会使提取液中的甲醛含量过低，导致不能检出或干扰较大，影响检测结果。同时称取空白乳粉2.0 g，加入甲醛标准溶液，使得甲醛最终加标量为3.0 mg/kg，分别经水浸法、水蒸气蒸馏法和衍生液提取法处理，计算得到加标回收率分别为63.4%、110.4%、96.9%。因此，综合考虑选择衍生液提取法提取乳粉样品中微量甲醛更为合适。

2.2 衍生液与沉淀剂的选择

比较2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 7水溶液（体积比1∶1）、2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 5磷酸盐缓冲液（体积比1∶1）和2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 2磷酸盐缓冲液（体积比1∶1）3 种衍生体系提取乳粉样品中甲醛的效果。

图 1 不同衍生体系对乳粉中甲醛的提取效果（n=3）Fig. 1 Extraction efficiency of formaldehyde from milk powder with different derivatization systems (n = 3)

由图1可知：pH 7体系的甲醛含量测定值较低，可见此条件不利于提取样品中的可逆结合态甲醛；pH 2体系的甲醛测定值较高，但样品中成分复杂，可能衍生形成其他醛类物质，其甲醛衍生物与甲醛标准品衍生物的GC谱图不能完全重叠，表明目标峰中存在杂质峰干扰；pH 5体系与pH 2体系的甲醛测定值接近，乳粉中蛋白质-甲醛复合物在弱酸性条件下受热分解释放出甲醛，衍生剂与甲醛反应形成稳定的甲醛衍生化物，有利于提取样品中可逆结合态甲醛，因此，选择2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 5磷酸盐缓冲液（体积比1∶1）作为衍生液。

由于乳粉样品中蛋白质含量较高，对甲醛的提取效果影响较大，需对其进行净化处理。选择三氯乙酸、乙酸铅和硫酸铵3 种常见的沉淀剂，比较三者沉淀效果。结果发现：采用三氯乙酸与乙酸铅作为沉淀剂，试剂空白值较高，干扰检测结果；而硫酸铵则能较好沉淀蛋白质和水溶性杂质，因此选择硫酸铵作为沉淀剂。

2.3 衍生温度的选择

图 2 衍生温度对甲醛衍生物峰面积的影响（n=3）Fig. 2 Influence of derivatization temperature on peak area of formaldehyde derivative (n = 3)

由图2可知，衍生温度40～90 ℃，随着衍生温度上升，甲醛衍生物的峰面积逐渐增加，当温度达到60 ℃时，继续升高温度，峰面积已趋于稳定，即衍生效率达到最大，因此选择60 ℃作为甲醛的衍生温度。

2.4 衍生时间的选择

图 3 衍生时间对甲醛衍生物峰面积的影响（n=3）Fig. 3 Effect of derivatization time on peak area of formaldehyde derivative (n = 3)

由图3可知，采用甲醛衍生物的峰面积表示衍生效率，随衍生时间的延长峰面积随之增加，60 min后趋于稳定。因此，衍生时间设定为60 min。

2.6 标准谱图与线性范围

图 4 甲醛标准溶液衍生物GC图谱Fig. 4 GC chromatogram of derivatized formaldehyde standard solution

由图4可知，甲醛标准溶液衍生物GC色谱峰形良好，无杂质峰干扰。以标准溶液中甲醛质量为横坐标（μg），响应峰面积为纵坐标绘制标准曲线，在0～10 μg范围内，线性关系良好，r均大于0.999。

图 5 甲醛标准溶液衍生物总离子流图（A）及对应质谱图（B）Fig. 5 Total ion current chromatogram (A) and mass spectrum (B) of derivatized formaldehyde standard solution

由图5可知，对于目标峰采用GC-MS进行确证，采用全扫描模式，扣除背景干扰后，将对应质谱图与NIST谱库进行匹配，找到甲醛衍生物（甲醛-2,4-二硝基苯腙）出峰位置，匹配度高达95.4%。

考虑离子丰度及受干扰程度，选择监测离子m/z为79、122、179、210，如图6所示。

图 6 甲醛标准溶液衍生物选择性离子监测谱图（A）及对应质谱图（B）Fig. 6 Selected ion monitoring chromatogram (A) and mass spectrum (B)of derivatized formaldehyde standard solution

对阳性乳粉样品中甲醛进行确证，背景扣除后，阳性乳粉样品选择性离子监测谱图及对应质谱图如图7所示。

图 7 阳性乳粉样品选择性离子监测谱图（A）及对应质谱图（B）Fig. 7 Selected ion monitoring chromatogram (A) and mass spectrum (B)of positive milk powder sample

2.7 检出限与定量限

选择适宜质量浓度的甲醛标准溶液进样，观察其噪音强度，将3 倍信噪比（RS/N）作为检出限，稀释甲醛标准溶液，使其在仪器上响应强度为3 倍信噪比，计算得甲醛检出限为0.1 mg/kg；稀释甲醛标准溶液，使其在仪器上响应强度为10 倍信噪比，以10 倍信噪比（RS/N）作为定量限，计算得甲醛定量限为0.3 mg/kg。结果表明，所建立的方法灵敏度较高。

2.8 加标回收实验与精密度实验

图 8 阴性乳粉样品GC图谱Fig. 8 GC chromatogram of negative milk powder sample

图 9 加标（0.3 mg/kg）乳粉样品GC图谱Fig. 9 GC chromatogram of spiked milk powder sample (0.3 mg/kg)

分别称取空白（阴性，不含甲醛）乳粉样品（实验室留样）约2.0 g共18 份，分别加入适量甲醛标准溶液，添加量分别达到定量限、2 倍定量限、10 倍定量限3 个添加水平，采用阴性样品进行系统空白背景考察，如图8～9所示，甲醛出峰位置基本无干扰。

表 3 甲醛在不同加标量下的加标回收率（n=6）Table 3 Recoveries of formaldehyde at different spiked concentrations (n= 6)

由表3 可知，不同加标水平下平均回收率为88.3%～96.7%，相对标准偏差小于10%。

2.9 不同冲调温度下乳粉中甲醛含量比较

图 10 不同冲调温度下甲醛含量变化Fig. 10 Change in formaldehyde content under different reconstitution temperatures

由图10可知，将相同质量乳粉分别直接按1.3.2节处理，与经40 ℃温水冲调后再按1.3.2节处理测得乳粉中甲醛含量基本一致。然而，当冲调温度大于40 ℃，随着温度继续升高，冲调后的乳粉样品中甲醛含量呈现上升趋势，分析可能原因为随着温度升高，促使美拉德反应发生，产生了新的甲醛。

2.10 网购乳粉样品的甲醛含量检测结果

为模拟实际摄入过程，使甲醛污染暴露评估更科学合理，对网购的45 份婴幼儿配方乳粉采用40 ℃温水进行冲调，溶解混合均匀后对其中甲醛含量进行测定。

表 4 45 份婴幼儿配方乳粉（经40 ℃温水冲调）中甲醛含量测定结果（n=3）Table 4 Results of determination of formaldehyde in 45 infant formula samples reconstituted with warm water at 40 ℃ (n= 3)

由表4可知，甲醛检出率为100%，虽然45 份婴幼儿配方乳粉样品总体甲醛含量（0.38～2.72 mg/kg）不高，但仍然可能会对以婴幼儿配方乳粉为主食的婴幼儿健康带来一定风险。

目前国内外针对甲醛的安全摄入量暂无明确要求，美国环境保护局建议甲醛每日允许摄入量（allowable daily intake，ADI）为0.2 mg/kg，ADI越大，说明该物质对人体健康的危害越小[19]。本研究中甲醛暴露风险暂按0.2 mg/kg来评估。由表4可知，12～36 月龄婴幼儿的甲醛平均暴露水平最高，这可能与其中某些营养强化剂含量有一定相关性，如硫酸亚铁、VC等，可促进婴幼儿配方乳粉中内源性甲醛的形成[7]。

3 结 论

采用GC法结合GC-MS对婴幼儿配方乳粉中甲醛含量进行测定与确证，通过优化前处理条件，对方法的线性范围、精密度、准确度、检出限及定量限等技术参数进行了评价。采用此法检测不同冲调温度下乳粉样品中甲醛含量的变化及网购45 份婴幼儿配方乳粉经冲调后的甲醛含量，结果显示，该检测方法灵敏、准确且重复性好。当冲调温度高于40 ℃，随着冲调温度的升高，甲醛含量逐渐增加，可能原因为高温促进了美拉德反应生成内源性甲醛，因此，冲调乳粉时水温不宜过高，一般按照产品推荐温度（40 ℃左右）较合适。对婴幼儿配方乳粉中甲醛平均暴露量进行统计，虽与ADI存在一定差距，但对于将配方乳粉作为主要营养摄入且体质较敏感的婴幼儿来说，尤其是12～36 月龄的婴儿，甲醛摄入带来的健康风险仍需引起足够的重视。关于影响乳粉中内源性甲醛形成的具体因素还有待于进一步挖掘与研究。