牛乳菌落总数测定的不确定度评定

井丽娟，王云霞，李翠枝，吕志勇，刘丽君*

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司质量管理部，内蒙古 呼和浩特 010110）

近年来食品安全问题倍受关注，菌落总数是评价食品卫生状况的一项重要指标[1-2]，通过检测菌落总数能够直观反映出食品卫生的优劣，为其卫生学评价提供数据支持。目前国内依据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定》[3]检测菌落总数，虽然检测步骤并不复杂，但检测结果的准确性却受到样品均匀性、样品制备、稀释过程、培养条件、菌落计数、仪器精度、实验环境等多种因素的影响，这些因素单独或复合对检测结果造成一定的误差，因此需要通过分析与评定这些因素引入的不确定度，进一步减少误差的影响。

不确定度是表征被测量的真值所处量值范围的评定[4-5]，按照某一置信概率给出真值可能落入的区间，可使检测数据更加客观和科学，尤其是当所检样品的检测结果接近判定限量值时，为了保证检测结果更为客观、精准，进行不确定度分析和评定就显得尤为重要和必要，这对提供准确的数据及据此数据出具符合性判定具有重要意义。

实验室认可文件CNAS-CL01-A001《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》[6]和CNAS-CL07《测量不确定度的要求》[7]都对微生物检测结果的不确定度评定提出了明确的要求：规定微生物检测实验室应考虑到检测中各种主要的不确定度分量，并有能力对每个量化的测量结果进行不确定度的评估，在某些情况下，考虑到检测结果的重要性，需要列出主要的不确定度分量，并做出合理评估。因此通过认可审核的检测实验室必须严格执行对微生物测定结果不确定度的分析与评定。

本研究依据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定》[3]检测牛乳样品的菌落总数，按照JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》规范[8]分析检测结果不确定度的来源并建立数学模型，然后分别对引入的不确定度分量进行评定，最终以合成计算的方法评定菌落总数的不确定度，通过有效评定菌落总数测定结果的不确定度[9-12]，能够进一步提升实验室检测数据的准确度和可靠性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛乳样品 市售；平板计数琼脂（plate counting agar，PCA）、无菌生理盐水 北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

ML1602电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；0400/001/EU无菌均质器 英国Seward公司；BPX-162电热恒温培养箱 上海博迅科技有限公司；GI54DW高压灭菌锅 厦门至微仪器有限公司；88880018漩涡振荡器美国Thermo Fisher公司；SW-CJ-2F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落总数测定

依据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验标准 菌落总数测定》[3]方法制备样品并检测：无菌量取25 mL牛乳样品至无菌均质袋内，加入225 mL无菌生理盐水，用拍击式均质器拍打1 min，制成1∶10的均匀样液；根据对该样品污染度的估计选择2～3 个连续稀释度，每个稀释度分别吸取1 mL稀释样液接种2 块平皿，同时以无菌生理盐水为空白对照；每块平皿倾注15～20 mL约46 ℃的PCA培养基，待培养基凝固后，翻转平皿并置于（36±1） ℃培养（48±2） h，计数各平板的菌落总数并报告结果。

1.3.2 不确定度评定

依据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》规范[8]分析和评估测定过程产生的不确定度分量，最终合成评定菌落总数的不确定度。

2 结果与分析

2.1 建立数学模型

根据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验标准 菌落总数测定》[3]中菌落总数的计算公式建立以下数学模型，选取菌落数30～300 CFU的平板进行计数，测定菌落总数，如式（1）所示。

式中：Y为单次测定菌落总数/（CFU/mL）；n为样品的稀释倍数；N为1 mL样品稀释液中的菌落数/CFU；V为样品稀释液的体积/mL。

2.2 分析不确定度来源

虽然菌落总数测定的检测步骤并不复杂，但影响菌落总数测定结果的因素包括很多，如样品称量的准确性、培养条件、均质时长、样品均一性、倍比稀释、菌落计数、重复测定等多个方面[13-14]。本研究主要从样品称量、稀释过程、加样体积、重复测定方面进行不确定度的分析与评定，由于本次实验由同一实验人员严格按照国标方法完成单一牛乳样品的检测，所以均质、培养和环境等因素对菌落总数结果不确定度的影响统一归入重复性测定中进行分析与评定。

2.3 不确定度分量评定

2.3.1 样品称量引入的不确定度

样品制备过程中使用量筒无菌量取25 mL牛乳样品至无菌均质袋内，依据JJG 196—2006《常用玻璃量器》[15]的规定：25 mL量入式量筒的容量允差绝对值为0.25 mL，按照三角分布考虑，包含因子则25 mL牛乳样品称量时引入的标准不确定度和对应的相对标准不确定度按式（2）～（3）计算。

式中：u（VS）为使用25 mL量筒量取25 mL牛乳样品过程中引入的标准不确定度；urel（VS）为对应的相对标准不确定度。

2.3.2 制样引入的不确定度

加入225 mL无菌生理盐水于上述称量的25 mL牛乳样品中，得到1∶10的稀释样液，根据JJG 196—2006《常用玻璃量器》[15]规定：250 mL量筒容量允差绝对值为1.0 mL，按照三角分布考虑，则使用250 mL量筒量取225 mL无菌生理盐水制备1∶10稀释样液过程中引入的标准不确定度和对应的相对标准不确定度按式（4）～（5）计算。

式中：u（VF）为使用250 mL量筒量取225 mL无菌生理盐水制备1∶10稀释样液过程中引入的标准不确定度；urel（VF）为对应的相对标准不确定度。

2.3.3 逐级稀释引入的不确定度

将牛乳样品逐级倍比稀释为1∶10、1∶100和1∶1 000的样液，在稀释过程中分别使用分度吸管移取1 mL和9 mL的稀释液，根据JJG 196—2006《常用玻璃量器》[15]的规定：1 mL分度吸管（A级）容量允差绝对值为0.008 mL，10 mL分度吸管（A级）容量允差绝对值为0.05 mL，按照三角分布考虑，，则样品在逐级倍比稀释过程中由1 mL分度吸管（A级）引入的标准不确定度u（VD1）和对应的相对标准不确定度urel（VD1）按式（6）～（7）计算。

由10 mL分度吸管（A级）引入的标准不确定度u（VD10）和对应的相对标准不确定度urel（VD10）按式（8）～（9）计算。

由菌落计数结果可知，该牛乳样品在1∶1 000稀释平板上的菌落数不符合计数范围，而在1∶10、1∶100稀释平板上的菌落数符合菌落总数的计数范围，可用于计算菌落总数的检测结果。牛乳样品在1∶10、1∶100逐级稀释过程中引入的相对标准不确定度urel（N）按式（10）计算。

2.3.4 加样体积引入的不确定度

选择适宜的稀释度，分别吸取1 mL稀释样液接种2 块平皿，吸取的加样体积为1 mL，不确定度主要来源于分度吸管的最大允许误差，根据JJG 196—2006《常用玻璃量器》[15]的规定：1 mL分度吸管（A级）容量允差绝对值为0.008 mL，按照三角分布考虑，，则加样过程引入的标准不确定度和对应的相对标准不确定度按式（11）～（12）计算。

式中：u（V）为使用1 mL分度吸管加样过程中引入的标准不确定度；urel（V）为对应的相对标准不确定度。

2.3.5 菌落总数测定的相对标准不确定度

由上述所得的逐级稀释引入的相对标准不确定度urel（N）和加样体积的相对标准不确定度urel（V），可以得到菌落总数测量的相对标准不确定度urel（Y），按式（13）计算。

式中：urel（Y）是从样品称量、制样过程、稀释过程、加样体积过程分析和评定得到的菌落总数测定的相对标准不确定度。

2.3.6 样品重复测定的标准不确定度

牛乳样品的菌落总数测定6 次，对每个稀释度平板上的菌落总数进行计数，然后将菌落总数测定结果取对数，计算其平均值和标准差，根据测量不确定度的A类评定方法对其进行统计学分析与评定，得到重复测量的标准不确定度。菌落总数测定结果见表1。

表 1 菌落总数计数结果Table 1 Results of APC

依据表1的数据，利用贝塞尔公式计算牛乳样品菌落总数测定的标准偏差，按式（14）计算。

式中：S为测定样品的标准偏差；ai为计数结果的对数值；a为计数结果对数值的平均值；n为平行样品数量。

又因本次实验中平行测定的次数为2 次，所以由样品重复测量引入的标准不确定度u（R）按式（15）计算。

2.4 合成标准不确定度

综合以上各不确定分量的计算结果，牛乳样品菌落总数测定的合成标准不确定度uc（YR）按式（16）计算。

2.5 扩展标准不确定度

根据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[8]要求：当包含概率p=95%、K=2时，计算扩展不确定度U，按式（17）计算。

2.6 结果报告

菌落总数测定结果的对数平均值为3.9 6 7，当p=95%、K=2时，该牛乳样品菌落总数测定结果的扩展不确定度U为0.043 4，所以结合扩展不确定度计算测定结果对数的取值区间为[3.967-0.043 4，3.967+0.043 4]，对此区间值取反对数即可得出该样品的菌落总数为8 395～10 233 CFU/mL。

3 讨 论

3.1 不确定度的类型

在日常检测分析实验室中不确定度的类型分为2 类：1）A类不确定度评定：用统计分析的方法对被测量进行不确定度评定，称为不确定度A类评定，它是通过多次重复测量，然后计算平均值、标准差，进而求得的测量不确定度[16-17]，A类评定是在重复性测定的基础上进行，充分考虑各个影响因素的作用，所以更为真实、客观、有说服力；2）B类不确定度评定：在实际测量中，不能或无需进行多次重复测量，其不确定度只能用非统计分析的方法进行评定，称为B类评定，它是根据实验、相关经验或信息来近似估计，一般需要先估计被测量的可能值区间，假设被测量值的概率分布，根据这一范围可能的分布进而推算不确定度。

3.2 不确定度的来源

微生物测定结果不确定度的来源非常复杂，影响因素较多，着重从检测实验的过程和实验环境方面进行考虑和分析[18-20]，如被测样品、所用的仪器设备、实验环境、操作人员和检测方法等，逐一分析后确定主要和关键的不确定度来源，进而对这些主要的不确定度分量进行计算与评定。

3.3 不确定度的评定

在对测定结果进行不确定度的评定过程中，首先确定被测量和测量方法，然后建立数学模型，分析被测量与各输入量之间的函数关系[20-24]；按照3.2节所述的各方面因素考虑和分析不确定度的来源；按照3.1节进行A类不确定度和B类不确定度的评定；通过计算各个不确定度分量进而合成标准不确定度；再根据被测量的概率分布、置信水平和包含因子计算扩展不确定度[25-26]，最终报告测定结果的不确定度，至此即完成了对测定结果不确定度的评定。

4 结 论

在菌落总数测定和数据统计的过程中首先应尽可能全面、充分考虑各类因素对测定结果产生的影响[27-28]，重点分析称量、加样、稀释、计数、重复测定等因素引入的不确定度，依据数学模型计算各不确定度分量引入的不确定度。由于菌落总数检测结果的数据发散性较大、不符合正态分布，不适用于直接计算其标准差，因此需取其对数后再进行数据的统计分析，利用贝塞尔公式计算标准不确定度，最终合成菌落总数测定的不确定度，以进一步减少各方面引入的误差，使检测结果更加接近真值。应用不确定度的分析与评定方法能够有效确保检测数据的准确性、可靠性、客观性和科学性，为微生物实验室的实际检测工作提供有力支持。