卵母细胞玻璃化冷冻与ICSI妊娠结局的相关性研究

邵淑敏，汪文诤，张玲，2，于江宇

(华中科技大学同济医学院 1.生殖医学中心；2.生殖健康研究所，武汉 430030)

卵母细胞玻璃化冷冻在临床中应用日益增多，如：体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗时，男方由于某种原因取精失败等不能行体外授精时，可将卵母细胞冷冻保存，待获取男方精子后，将冷冻卵母细胞解冻后再行卵胞浆内单精子注射(ICSI)-ET治疗，可提高卵母细胞的利用率，最大程度地降低不孕夫妇的损失；肿瘤患者进行放化疗会损伤卵巢功能，将卵母细胞进行冷冻保存，可保存其生殖能力；卵巢反应不良患者多次取卵，冷冻保存来募集卵母细胞数量；卵母细胞冷冻保存后用于捐赠等[1]。玻璃化冷冻避免了卵母细胞在冷冻-复苏过程中胞质冰晶的形成，使其冷冻复苏率和胚胎发育潜能获得一定的提高，并于1999年获得首例玻璃化冷冻卵母细胞来源的健康婴儿[2]。随着玻璃化冷冻技术和ICSI技术的发展，卵母细胞玻璃化冷冻逐渐成为临床上重要的一种衍生技术，至今有将近4 000个来源于玻璃化冷冻卵母细胞的新生儿出生[3]。

虽然卵母细胞玻璃化冷冻技术已在辅助生殖中心实验室中普遍应用，但每个生殖中心的玻璃化冷冻操作规程均不一致，卵母细胞复苏率和临床妊娠率差异也较大。本研究回顾性分析本中心因取卵日取精失败或卵母细胞捐赠行卵母细胞玻璃化冷冻，复苏后行ICSI治疗患者的受精率、优质胚胎率、临床妊娠率和种植率等临床结局，以及流产率、早产率、新生儿出生体重等妊娠产科结局，与同期新鲜卵母细胞ICSI治疗结局相比较，探讨卵母细胞玻璃化冷冻技术在辅助生殖治疗中临床应用的可行性和有效性，并为规范卵母细胞玻璃化冷冻操作方法提供参考依据。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2018～2019年在本生殖中心行IVF-ET治疗，但因取卵日取精失败或卵母细胞捐赠行卵母细胞玻璃化冷冻的14例患者(冷冻组)的临床资料。14例患者共有99枚卵母细胞玻璃化冷冻复苏后行ICSI治疗。

患者纳入标准：女方年龄≤35岁，卵巢功能正常；卵母细胞捐赠者年龄≤35岁。排除标准：子宫内膜<6 mm或子宫内膜曾发生粘连等损伤；子宫畸形如双角子宫、子宫纵膈等；子宫内膜炎、子宫内膜异位症、子宫腺肌症；输卵管积水；染色体异常等。

选择同期在本生殖中心行新鲜卵母细胞ICSI周期的88例患者为新鲜组。统计分析两组患者ICSI周期的临床结局和妊娠产科结局。

二、研究方法

1.卵母细胞玻璃化冷冻/复苏：卵母细胞玻璃化冷冻在取卵后2 h左右进行。冷冻前用80 IU透明质酸酶(Sigma，美国)将卵母细胞周围大部分的颗粒细胞脱去，选择MⅡ成熟卵母细胞进行冷冻。采用玻璃化冷冻试剂盒(KITAZATO，日本)在室温下进行冷冻，在3002皿盖(BD，美国)制作ES、VS液滴各两滴，每滴200 μl，置于室温下至少30 min预温。冷冻过程：将卵母细胞置于ES滴，平衡10～15 min，具体时间可根据卵母细胞皱缩后复原的时间为准。复原后置入VS滴，平衡90 s，放置于载杆上，迅速将载杆一端置入液氮中，并来回水平移动数次，垂直投入液氮，冷冻保存。

卵母细胞玻璃化复苏：采用玻璃化解冻试剂盒(KITAZATO，日本)，在3007皿(BD，美国)中制作WS1液滴，在五孔皿(Vitrolife，美国)中制作WS2、WS3、WS4液滴，WS1液滴置于37℃恒温培养箱(无需CO2)中预热，其余置于室温下至少30 min平衡。从液氮中取出载杆，分别进行如下操作：WS1，1 min，37℃热台上操作；其余步骤在室温下操作：WS2，3 min；WS3，5 min；WS4，3 min，然后将卵母细胞放入卵裂期培养液G1 Plus(Vitrolife，美国)培养液中清洗，并放入桌面培养箱(COOK，澳大利亚)中培养。

2.ICSI授精：男方禁欲2～7 d，于卵母细胞复苏日手淫法取精，待精液完全液化后，根据精子活力和浓度，应用商品化密度梯度液Spermgrad(Vitrolife，美国)，采用密度梯度离心结合上游法或直接离心法优化处理精液。卵母细胞复苏后培养2 h，选择复苏后存活的MⅡ卵母细胞进行ICSI授精，然后将ICSI后卵母细胞转入卵裂期培养液G1 Plus(Vitrolife，美国)，置入桌面培养箱(COOK，澳大利亚)中培养。

3.胚胎评估：ICSI受精后培养16～18 h观察原核形成情况，若观察到出现双原核和两个极体，则为正常受精；若观察到多原核或单原核，则为异常受精。胚胎培养第2天和第3天观察胚胎细胞卵裂情况并按照编号进行详细记录，包括观察时间、细胞数、胚胎分级、均匀度、碎片、空泡、多核等，胚胎培养第3天根据胚胎发育情况决定移植及冷冻的胚胎；异常受精胚胎在胚胎培养第3天直接废弃。

根据胚胎卵裂球大小是否一致、碎片率及细胞质颗粒现象，将胚胎分为4级，卵裂期胚胎评分标准[4]：Ⅰ级：胚胎卵裂球等大，形态规则，胞质均匀清晰，碎片无或少于10%。Ⅱ级：胚胎卵裂球不等，形态欠规则，碎片10%～25%。Ⅲ级：胚胎卵裂球大小不均，形态欠规则，碎片25%～50%。Ⅳ级：胚胎卵裂球大小严重不均，碎片大于50%。

囊胚分级标准：根据Gardner评分系统[5]，对囊胚进行分级，包括囊胚腔分期、内细胞团分级及滋养细胞层分级。其中，囊胚腔分期(1～6期)：1期为囊胚腔<胚胎总体积的1/2；2期为囊胚腔≥胚胎总体积的1/2；3期为囊胚腔充满整个胚胎；4期为囊胚腔充满整个胚胎，并且胚胎总体积变大，透明带变薄；5期为囊胚部分从透明带中逸出；6期为囊胚全部从透明带中逸出。内细胞团分级(A～C级)：A级为细胞数目多，排列紧密；B级为细胞数目少，排列松散；C级为细胞数目极少。滋养层细胞分级(A～C级)：A级为上皮细胞层由较多的细胞组成，结构致密；B级为上皮细胞层由不多的细胞组成，结构松散；C级为上皮细胞层由稀疏的细胞组成。

4.胚胎移植：B超监测卵泡发育和内膜情况，排卵日内膜厚度>7 mm时，开始肌肉注射黄体酮进行黄体支持，当日玻璃化复苏卵母细胞并行ICSI授精，胚胎培养第3～5天行胚胎移植。胚胎移植后14 d测定血清中β-HCG值，胚胎移植后35 d进行超声检查，宫腔内见孕囊或流产物见绒毛确诊为临床妊娠。

三、临床结局和妊娠产科结局指标

临床结局观察指标包括卵母细胞复苏率(卵母细胞复苏后存活数占复苏卵母细胞总数的比例)、受精率(包括总受精率：2PN卵母细胞数、1PN数和多PN数占注射MⅡ卵母细胞总数的比例；正常受精率：受精后第1天(D1)出现2PN卵母细胞数占注射MⅡ卵母细胞总数的比例)、卵裂率(正常受精卵裂胚胎数占受精卵母细胞数的比例)、优质胚胎率(来源于正常受精卵，且受精后D3胚胎细胞数为7～9个，碎片程度小于10%的胚胎比例)、临床妊娠率(临床妊娠周期数占移植周期数的比例)、种植率(孕囊数占移植胚胎数目的比例)。

妊娠产科结局观察指标包括异位妊娠率、早期流产率(<12孕周流产者比例)、晚期流产率(12～27+6孕周流产者比例)、活产率、早产率(28～36+6孕周分娩者比例)、巨大儿(出生体重≥4 000 g)、低出生体重儿(出生体重1 500～2 499 g)、新生儿出生缺陷率、围产儿死亡率(妊娠28足周后的死胎、死产及新生儿出生1周内的死亡比例)。

四、统计学分析

采用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析。显著性检验采用卡方检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、两组患者基础资料比较

本生殖中心有14例患者进行卵母细胞玻璃化冷冻复苏，共有99枚卵母细胞复苏后行ICSI-ET周期(冷冻组)，女方平均年龄(30.86±3.74)岁。新鲜卵母细胞ICSI-ET周期(新鲜组)88例为对照，平均年龄(32.29±1.90)岁。两组间女方平均年龄、不孕年限和基础FSH值比较均无统计学差异(P>0.05)；两组间男方平均年龄、精子浓度和精子活力比较均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 冷冻组和新鲜组患者基础资料比较 (-±s)

二、两组实验室指标和临床结局分析

1.实验室指标：99枚卵母细胞行玻璃化冷冻复苏，存活84枚，卵母细胞复苏率84.85%；84枚成熟卵母细胞行ICSI授精，受精61枚，总受精率72.62%，其中正常受精卵56枚，正常受精率66.67%；胚胎培养第3天形成胚胎55枚，卵裂率98.21%，其中优质胚胎24枚，优质胚胎率43.64%。冷冻组和新鲜组的MⅡ卵率、受精率、卵裂率比较均无统计学差异(P>0.05)，但冷冻组的优质胚胎率显著低于新鲜组(P<0.05)(表2)。

表2 冷冻组和新鲜组实验室指标比较(%)

2.临床结局：冷冻组新鲜胚胎移植周期10例，获得6例临床妊娠，临床妊娠率60.00%；移植19枚卵裂期胚胎，其中6枚胚胎着床，胚胎种植率31.58%。冷冻组和新鲜组移植时女方年龄和移植胚胎数比较均无统计学差异(P>0.05)；虽然新鲜组的临床妊娠率和胚胎种植率均略高于冷冻组，但尚无统计学差异(P>0.05)。进一步分析两组间卵裂期胚胎和囊胚移植的临床结局发现，两组间卵裂期胚胎的临床妊娠率和胚胎种植率比较均无统计学差异(P>0.05)；由于冷冻组无囊胚移植周期，因此两组间囊胚移植的临床结局未做统计学分析(表3)。

三、妊娠产科结局分析

子代随访结果分析发现，冷冻组和新鲜组的异位妊娠率、早期流产率、晚期流产率、早产率、低出生体重率、巨大儿率、新生儿出生缺陷率、围产儿死亡率等产科结局比较均无统计学差异(P>0.05)。两组间性别比也无统计学差异(P>0.05)，男女性别比分别为1∶1和1∶0.84(表4)。

表3 冷冻组和新鲜组临床结局比较[(-±s)，%]

表4 冷冻组和新鲜组妊娠产科结局比较(%)

讨 论

卵母细胞体表比例大，胞内含有大量水分，胞膜渗透性差，纺锤体对温度敏感，冷冻-复苏过程可影响染色体和微观结构的正常，使冷冻卵母细胞的复苏存活率、受精率、胚胎发育能力和临床妊娠率较低[6]。目前国内外很多研究小组通过改进冷冻方法、稳定卵母细胞结构、改善代谢水平来提高其冷冻结局，但研究进展相对缓慢[7-8]。卵母细胞玻璃化冷冻采用开放式的操作方式，利用高浓度的冷冻保护剂，将卵母细胞直接暴露于液氮中，使其超快速冷冻达到玻璃化状态，减少冰晶形成，降低冷冻-复苏过程对卵母细胞的损伤；卵母细胞玻璃化冷冻有利于减数分裂纺锤体的迅速恢复，可明显提高卵母细胞的复苏存活率和临床妊娠率[9]。

本研究回顾性分析玻璃化冷冻卵母细胞的复苏存活率以及ICSI治疗的受精率、卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率和胚胎种植率等实验室和临床结局指标，以新鲜卵母细胞ICSI周期为对照组进行比较分析，数据表明玻璃化冷冻卵母细胞的复苏存活率为84.85%，这与其他研究报告的复苏存活率85.6%[10]相近；冷冻卵母细胞ICSI的优质胚胎率显著低于新鲜卵母细胞(P<0.05)。Braga等[11]报道，与新鲜卵母细胞组胚胎相比，玻璃化冷冻卵母细胞组的胚胎质量和囊胚形成率均较低；Coticchio等[12]也发现卵母细胞玻璃化冷冻复苏后，其纺锤体和赤道染色体排列正常率为32.6%，远低于新鲜卵母细胞的59.1%，冷冻组的胚胎质量显著低于新鲜组，可能是因为玻璃化冷冻会对卵母细胞的纺锤体和染色体等造成不同程度的损伤，使胚胎质量和发育潜力降低。此外，玻璃化冷冻卵母细胞mRNA丢失率高达36.7%，也可能是导致玻璃化冷冻卵母细胞形成的胚胎发育潜力降低的重要因素[13]。

本研究显示，冷冻组和新鲜组的受精率、卵裂率、临床妊娠率和胚胎种植率比较均无统计学差异(P>0.05)，冷冻组移植优质胚胎后可获得与新鲜组相似的临床结局。Meta分析也表明玻璃化冷冻卵母细胞和新鲜卵母细胞行IVF/ICSI治疗的受精率、卵裂率和临床妊娠率无统计学差异[14]；美国一项关于卵母细胞慢速冷冻或玻璃化冷冻的回顾性分析研究显示，年轻患者(女方年龄<37岁)冷冻卵母细胞的复苏存活率为89%、受精率为78%、种植率为45%、移植周期活产率为58%，年轻患者冷冻卵母细胞可获得与新鲜卵母细胞相似的临床结局[15]。因此美国生殖医学协会颁布的卵母细胞冷冻保存指南提出卵母细胞冷冻复苏应该不再被认为是一种实验技术，而是可应用于临床[9]。但这些试验数据大部分来源于年轻患者，数据结果不能直接反映其他患者群体，尤其是高龄患者。意大利多中心数据研究发现，新鲜卵母细胞的临床结局优于慢速冷冻卵母细胞，每周期移植两枚胚胎时，冷冻卵母细胞周期的受精率、种植率、妊娠率和活产率均低于新鲜卵母细胞周期[16]；来源于193家生殖中心共计120 000个IVF周期的大数据分析也表明新鲜卵母细胞移植周期的种植率和临床妊娠率高于冷冻卵母细胞[17]。中华医学会中国专家共识也提出卵母细胞冷冻技术还不成熟，临床应用时间较短，安全性有待观察，应谨慎应用[18]。

冷冻卵母细胞临床结局的差异可能是由于各项研究中患者群体的选择和卵母细胞冷冻方案的差异造成的。Ubaldi等[19]研究表明年龄是影响冷冻卵母细胞成功率的重要因素，高龄患者(女方年龄>38岁)冷冻卵母细胞的种植率、临床妊娠率和持续妊娠率明显低于年轻患者，不同年龄段患者(女方年龄<34岁、35～37岁、38～40岁、41～43岁)的移植周期临床妊娠率分别为48.6%、24.1%、23.3%和22.2%，冷冻复苏卵母细胞移植周期的妊娠率随着女方年龄的增加而逐渐降低；冷冻方案的选择也会影响冷冻卵母细胞复苏存活率和临床结局，玻璃化冷冻卵母细胞的复苏存活率、受精率、囊胚发育和临床妊娠率明显高于慢速冷冻。但也有研究表明卵母细胞玻璃化冷冻和慢速冷冻的成功率相似，且卵母细胞玻璃化冷冻也会对卵母细胞的染色体、纺锤体和透明带等造成一定程度的损伤，因此患者群体、冷冻方案、冷冻保护剂的选择和浓度、封闭式或开放式冷冻载杆和复苏速率均会影响冷冻卵母细胞的妊娠率[9]。

本研究中冷冻组和新鲜组间流产率、早产率、低出生体重率、巨大儿率、新生儿出生缺陷率、围产儿死亡率等妊娠产科结局比较均无统计学差异(P>0.05)。据相关文献报道，冷冻和新鲜卵母细胞在胎儿及围产期并发症和先天异常的发生率上并没有显著差异[20]。卵母细胞的玻璃化冷冻并不会降低患者临床妊娠率，也不会导致胎儿围产期并发症和先天异常的增加，在辅助生殖治疗中，可作为取精失败或肿瘤患者生育力保存等有效的补救措施[21]。

目前临床上缺乏标准的卵母细胞玻璃化冷冻方案。本生殖中心中收集的冷冻卵母细胞数据均来源于年轻患者，HCG注射后36 h取卵，卵母细胞取出后短暂培养2 h，用透明质酸酶消化后脱掉卵母细胞周围大部分的颗粒细胞，注意勿过度消化；脱颗粒细胞后培养30 min行卵母细胞玻璃化冷冻，采用连线法在冷冻保护剂ES液滴中平衡10～15 min，待卵母细胞皱缩复原后转入VS液滴中，平衡90 s，此处平衡时间不能过短，要使卵母细胞与VS液滴充分作用，迅速装入冷冻载杆中投入液氮；卵母细胞复苏后培养2 h，即可进行ICSI授精。玻璃化冷冻方法可提高卵母细胞受精率，降低卵母细胞退化率。虽然卵母细胞玻璃化冷冻复苏后可获得良好的受精率和临床结局，但也无法避免ICSI本身存在的风险。卵母细胞玻璃化冷冻技术对母体和子代的短期风险较低，但与其他辅助生殖技术应用一样，仍需要注意其对人类远期健康影响的数据积累和研究。