TWIST2通过调控FGF21介导的AMPK/mTOR通路诱导卵巢癌细胞氧化应激和凋亡

盛连兵，刘皎婧，雷丽君，杨慧军

(山东省妇幼保健院生殖医学中心，济南 250014)

TWIST相关蛋白2(TWIST2)属于碱性螺旋-环-螺旋(Basic helix-loop-helix protein，bHLH)家族B类成员[1]，在骨发育、肿瘤发生与进展和上皮间充质转化过程中起着至关重要的调控作用[2-3]。目前，关于TWIST2在卵巢癌中作用的研究报道较少，仅有报道其在卵巢癌患者癌细胞中的表达情况[4-5]，但其在卵巢癌细胞中的功能仍需要进一步探究。

成纤维细胞生长因子21 (FGF21)主要在肝脏中合成，被认为是一种肝脏激素，在控制肝脏脂质代谢过程中发挥一系列作用，但对其在癌症中的研究较少[6-7]。有文献报道，TWIST2对FGF21的表达具有调控作用，当TWIST2过表达时，可以通过调控FGF21进而缓解肝细胞的脂肪变性、抑制炎症、增加线粒体含量并改善其功能，从而在维持肝脏稳态中发挥重要作用[8]。AMPK是一种异源三聚体蛋白质激酶，缺氧应激可激活细胞内的AMPK，其在能量代谢和凋亡的调控中起到重要作用[9]。mTOR是一种丝氨酸蛋白质激酶，可接受并整合细胞内外的各种刺激，调节细胞生长、增殖、自噬、凋亡等生物行为。mTOR被认为是AMPK的下游分子，细胞内AMPK被激活后可通过调控mTOR磷酸化水平，进而促进细胞凋亡[10]。

本研究旨在探究TWIST2是否通过调控FGF21介导的AMPK/mTOR通路影响卵巢癌细胞的氧化应激和凋亡以及其作用机制，从而为临床上卵巢癌的治疗提供新的理论依据。

材料与方法

一、材料和主要试剂、仪器

1.组织样本和细胞系：收集2018年6月至2019年10月在山东省妇幼保健院治疗并经病理确诊的30例卵巢癌患者的癌组织和癌旁组织，样本大小约500 mg，离体后20 min内快速行冰冻病理检查确认，液氮中保存备用。本研究获得医院伦理委员会批准，患者均对研究知情并签署知情同意书。研究所用卵巢癌细胞系(SK-OV-3、HO-8910、COC1和A2780)和正常卵巢上皮细胞(IOSE80)购自中国科学院昆明动物研究所。

2.试剂和仪器：Trizol、反转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自美国Promega公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清、双抗购自美国HyClone公司；BCA蛋白质定量检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；TWIST2兔抗鼠单克隆抗体、FGF21兔抗鼠单克隆抗体、NF-κB(p-p65)兔抗鼠磷酸化单克隆抗体、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)兔抗鼠单克隆抗体、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)兔抗鼠单克隆抗体、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)兔抗鼠单克隆抗体、p-AMPK兔抗鼠单克隆抗体、p-mTOR兔抗鼠单克隆抗体和GAPDH鼠单克隆抗体购自美国Abcam公司；转染试剂LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen公司；PCR引物、pcDNA3.1-TWIST2质粒由上海生工生物科技有限公司设计、合成；二氧化碳培养箱购自上海力申科学仪器有限公司；Bio-Rad T100荧光定量PCR仪和Bio-Rad iMark酶标仪购自美国BIO-RAD公司；BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪购自美国BD公司；WST-8、细胞计数试剂盒CCK试剂、细胞凋亡检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒、活性氧(ROS)检测试剂盒、ATP检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；RNA提取试剂盒购自日本Takara公司；AMPK激活剂(A-769662)购自北京百奥莱博科技有限公司；NAD+/NADH检测试剂盒购自美国Bio Vision公司；2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)试剂购自美国Sigma公司。

二、研究方法

1.细胞培养：实验细胞常规培养于RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清及100 U/ml双抗)，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱，隔天换液，细胞融合至80%～90%时传代，传至第三代进行后续实验。

2.细胞转染及分组：pcDNA3.1-TWIST2质粒、阴性对照质粒pcDNA3.1及pcDNA3.1-FGF21质粒均由上海生工生物科技有限公司设计、构建。按照Lipofectamine3000说明书将pcDNA3.1-TWIST2质粒、阴性对照pcDNA3.1质粒及pcDNA3.1-FGF21质粒分别转染至SK-OV-3和HO-8910细胞中，命名为TWIST2组、阴性对照组和FGF21组，空白对照组不转染任何质粒。置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养48 h后，于荧光显微镜下观察转染效率，分别记录细胞总数及绿色荧光的细胞个数。转染效率=绿色荧光的细胞数/细胞总数×100。实验设置3个重复。

3.qRT-PCR：取组织样本200 mg，加入1 ml Trizol剪碎，加入1/5体积的氯仿，12 000g离心15 min，吸取上层无色水相移入新EP管中，加入等体积的异丙醇，12 000g离心后管底可见微量RNA沉淀，75%乙醇洗一遍，干燥后加入无RNase水溶解沉淀，即为组织总RNA，备用。将SK-OV-3、HO-8910、COC1、A2780四种卵巢癌细胞和正常卵巢上皮细胞(IOSE80)分别以1×105个/孔的密度接种于12孔板，培养24 h后吸去上清液，收集细胞，依照RNA提取试剂盒说明书中的方法提取细胞总RNA。然后按照逆转录试剂盒说明书的操作方法进行逆转录，再以cDNA为模板，进行qRT-PCR，引物序列如表1所示，反应条件为：95℃ 10 min，95℃ 20 s，60℃ 1 min，扩增35个循环。按照2-ΔΔCt方法计算mRNA的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列及产物长度

4.细胞活力的检测：pcDNA3.1-TWIST2质粒、阴性对照质粒分别转染SK-OV-3和HO-8910细胞，以1×105个/孔的密度接种于96孔板中，向培养板中加入不同浓度(5、10、20、40、80、160 μg/ml)的WST-8，每个浓度设3个复孔并设空白对照，于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h；每孔加入20 μl CCK溶液，孵育24 h；酶标仪测定450 nm处的OD值。以上实验重复3次，取平均值。

5.细胞凋亡率的测定：pcDNA3.1-TWIST2或阴性对照质粒分别转染SK-OV-3和HO-8910细胞，于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h；将细胞以1×105个/孔的密度接种在6孔板中。根据细胞凋亡检测试剂盒的说明，用冷的PBS将细胞洗涤两次，然后用细胞凋亡检测试剂盒中的膜联蛋白V-FITC/PI染色。细胞凋亡率用流式细胞仪分析。以上实验重复3次。

6.Western blot检测蛋白表达量：提取组织和细胞的总蛋白，BCA蛋白质定量检测试剂盒测定蛋白含量。分别从每个组织和细胞样品取30 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法将蛋白转移至PVDF膜上；室温5%脱脂奶粉封闭1 h，加入用3% BSA按1∶1 000稀释的TWIST2、GAPDH一抗，按1∶500稀释的FGF21、p-AMPK、p-mTOR一抗，4℃过夜；二抗按1∶10 000稀释，室温孵育2 h，TBST清洗后，ECL显影，凝胶成像仪拍照(GAPDH为内参)。

7.细胞氧化应激的检测：将pcDNA3.1-TWIST2、阴性对照质粒分别转染至SK-OV-3和HO-8910细胞中，用于以下实验：(1)ROS含量检测：将各组细胞以1×105个/孔的密度接种在6孔板中，培养48 h后收集细胞；用浓度为10 μmol/L的DCFH-DA重悬细胞，根据ROS检测试剂盒说明书操作，37℃避光孵育20 min，弃上清液，PBS清洗3遍，流式细胞仪检测荧光强度。(2)SOD活性检测：采用WST-8法检测SOD活性，将各组细胞以1×105个/孔的密度接种在6孔板中，48 h后收细胞提取蛋白质，按照SOD检测试剂盒说明书操作，取20 μl样品，依次加入150 μl WST-8/酶工作液和20 μl反应启动液，37℃孵育20 min，在波长450 nm处测定吸光度。(3)ATP含量检测：按照ATP检测试剂盒说明书配制ATP检测工作液，各组细胞以1×105个/孔的密度接种在96孔板中，48 h后收细胞提取蛋白质；100 μl检测工作液中加入50 μl样本液，37℃避光孵育30 min，波长570 nm处测定吸光度值。(4)NAD+/NADH检测：按照NAD+/NADH检测试剂盒配制检测液，细胞以1×105个/孔的密度接种在96孔板中，48 h后收细胞提取蛋白；将80 μl配置好的样本液加入检测液中，37℃避光孵育1 h，在波长460 nm处测定吸光度值。实验重复3次。

三、统计学处理

结 果

一、荧光显微镜和qRT-PCR检测转染情况

TWIST2组、阴性对照组和FGF21组的SK-OV-3和HO-8910细胞培养了48 h后，倒置荧光显微镜下观察带有绿色荧光的细胞，转染效率均在50%以上，空白对照组未见绿色荧光(图1)。

qRT-PCR检测结果显示，pcDNA3.1-TWIST2质粒转染SK-OV-3和HO-8910细胞后，TWIST2组的TWIST2 mRNA表达量均显著高于空白对照组与阴性对照组(P<0.01)。pcDNA3.1-FGF21质粒转染SK-OV-3和HO-8910细胞后，FGF21组的FGF21 mRNA表达量均显著高于空白对照组与阴性对照组(P<0.01)(图2)。

A、E：空白对照组；B、F：阴性对照组；C、G：TWIST2组；D、H：FGF21组图1 荧光显微镜下观察质粒转染效率

A：TWIST2 mRNA表达水平；B：FGF21 mRNA表达水平。与TWIST2组或FGF21组比较，*P<0.01图2 各组细胞中TWIST2与FGF21的mRNA表达水平

二、TWIST2在卵巢癌组织和卵巢癌细胞中的表达

利用qRT-PCR和Western blot实验检测组织和细胞中TWIST2的表达量。结果显示，TWIST2在卵巢癌组织中的表达量显著低于癌旁组织(P<0.05)(图3)。TWIST2在SK-OV-3、HO-8910、COC1和A2780卵巢癌细胞中的表达量均显著低于人正常卵巢上皮细胞中的表达量(P<0.05)(图4)。

三、TWIST2对卵巢癌细胞SK-OV-3和HO-8910凋亡的影响

在SK-OV-3和HO-8910细胞中分别转染pcDNA3.1-TWIST2质粒或阴性对照质粒后，检测细胞活力及细胞凋亡情况。结果显示，与空白对照组相比，TWIST2 组细胞活力显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著提高(P<0.05)(图5)。

A：TWIST2 mRNA的表达量；B：TWIST2 蛋白的表达量。与癌旁组织比较，*P<0.05图3 TWIST2在卵巢癌组织和癌旁组织中mRNA和蛋白表达水平

A：TWIST2 mRNA的表达量；B：TWIST2蛋白的表达量。与正常卵巢上皮细胞比较，*P<0.05图4 TWIST2在正常卵巢上皮细胞和卵巢癌细胞中mRNA和蛋白质的表达水平

A：卵巢癌细胞活力比较；B：卵巢癌细胞凋亡率比较。与TWIST2组比较，*P<0.05。C：流式细胞仪检测卵巢癌细胞凋亡图5 TWIST2对SK-OV-3和HO-8910两种卵巢癌细胞的细胞活力与细胞凋亡率的影响

与空白对照组相比，TWIST2组凋亡蛋白caspase-3、促凋亡蛋白Bax的表达量显著增加(P<0.05)，而抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量显著降低，因此Bax/Bcl-2的比值显著增大(P<0.05)(图6)。以上结果说明TWIST2促进SK-OV-3和HO-8910细胞的凋亡。

A：caspase-3蛋白表达量；B：Bax/Bcl-2比值。与TWIST2组比较，*P<0.05。C：Western blot检测caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白条带图图6 TWIST2对SK-OV-3和HO-8910两种卵巢癌细胞中caspase-3蛋白表达量和Bax/Bcl-2比值的影响

四、TWIST2对卵巢癌细胞SK-OV-3和HO-8910氧化应激的影响

SK-OV-3和HO-8910细胞中分别转染pcDNA3.1-TWIST2质粒或阴性对照质粒后，检测不同处理组细胞内氧化应激相关因子的水平。结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，TWIST2组ROS水平显著增加(P<0.05)，NAD+/NADH及ATP水平显著降低(P<0.05)；SOD的酶活力显著降低(P<0.05)(图7)。以上结果说明TWIST2对SK-OV-3和HO-8910细胞的氧化应激起到促进作用。

五、TWIST2对FGF21及AMPK/mTOR通路相关蛋白的影响

在SK-OV-3细胞中分别转染pcDNA3.1-TWIST2质粒或阴性对照质粒后检测FGF21、p-AMPK和p-mTOR的蛋白表达量。结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，TWIST2组中FGF21、p-AMPK、p-mTOR蛋白的表达量显著降低(P均<0.05)(图8)。

A：ROS水平比较；B：NAD+/NADH水平比较；C：ATP水平比较；D：SOD活力比较。与TWIST2组比较，*P<0.05图7 TWIST2对SK-OV-3和HO-8910两种卵巢癌细胞氧化应激水平的影响

A：Western blot检测FGF21、p-AMPK和p-mTOR蛋白的条带图；B：FGF21蛋白表达量；C：p-AMPK蛋白表达量；D：p-mTOR蛋白表达量。与TWIST2组比较，*P<0.05图8 TWIST2对卵巢癌细胞SK-OV-3中FGF21、p-AMPK和p-mTOR蛋白表达量的影响

进一步研究发现，FGF21在卵巢癌组织中的表达量显著高于癌旁组织中的表达量(P<0.05)，且FGF21与TWIST2在卵巢癌组织中的表达量呈显著的负相关关系(r=-0.625 4，P<0.01)(图9)。以上结果说明TWIST2可以抑制FGF21的表达，抑制AMPK/mTOR通路的激活。

六、FGF21介导的AMPK/mTOR通路参与TWIST2对卵巢癌细胞的作用机制

为了进一步探究TWIST2对卵巢癌细胞作用的分子机制，在SK-OV-3细胞中分别转染pcDNA3.1-TWIST2质粒、pcDNA3.1-FGF21质粒或AMPK激活剂(A-769662)，检测不同处理组的细胞凋亡和细胞氧化应激情况。结果显示，与TWIST2组比较，转染FGF21质粒及AMPK激活剂后p-AMPK、p-mTOR蛋白表达显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率和ROS的水平显著降低(P<0.05)，逆转了TWIST2的抑制作用(图10)。以上结果表明FGF21介导的AMPK/mTOR通路参与TWIST2对卵巢癌细胞的作用途径。

A：FGF21蛋白表达水平；与癌旁组织比较，*P<0.05。B：TWIST2和FGF21的相关性图9 卵巢癌组织中FGF21蛋白表达水平及FGF21与TWIST2的相关性

A：Western blot检测p-AMPK、p-mTOR的蛋白条带图；B：p-AMPK蛋白表达水平；C：p-mTOR蛋白表达水平；D：卵巢癌细胞凋亡率；E：ROS水平变化。与空白对照组比较，*P<0.05；与TWIST2组比较，#P<0.05图10 FGF21和AMPK激活剂对TWIST2组氧化应激水平和凋亡率的影响

讨 论

卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌[11]。卵巢恶性肿瘤中以上皮癌最多见，其次是恶性生殖细胞肿瘤。卵巢上皮癌死亡率居各类妇科肿瘤的首位，对女性生命造成严重威胁[12]。由于卵巢位于盆腔深处、体积小，发生病变时缺乏典型临床症状，所以很难早期发现。卵巢上皮癌患者手术中局限于原发灶的病例较少，大多数病例的癌细胞已扩散到盆腹腔各个器官，所以早期诊断卵巢上皮癌是临床难题之一，对卵巢上皮癌进行更深层次的研究报道越来越多。

许多研究发现TWIST2在肿瘤转移过程中发挥了核心作用，其主要通过影响上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达从而改变肿瘤细胞的迁移和侵袭能力[13]。TWIST2在肿瘤发生中有双重作用，该蛋白在多种人类肿瘤中均有高表达，具有致瘤作用，但在某些肿瘤中表达降低，具有抑瘤作用[14]。但是，TWIST2在卵巢癌中的报道较少，尤其是对TWIST2在肿瘤中所参与的信号通路和分子机制的研究较少。2016年Zhang等[15]研究发现，TWIST2通过调控细胞外基质(ECM)受体相互作用途径中整合素α6(ITGA6)和整合跨膜糖蛋白44(CD44)的表达，促进了肾癌细胞的增殖和侵袭，且与国际妇产科学联合会(FIGO)确定的肾癌分期和淋巴结转移程度呈正相关。此外，相比于TWIST1，抑制TWIST2其表达后可以显著上调E-钙黏蛋白(E-Cadherin)表达同时下调N-Cadherin表达，进而抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力[16]。然而，TWIST2对癌症淋巴结转移的分子调控机制和信号通路，仍有待进一步探索。与上述结论一致的是，本研究发现，TWIST2可以显著抑制卵巢癌细胞的增殖，并诱导细胞氧化应激，促进细胞凋亡，说明TWIST2在人类卵巢癌的发生发展过程中发挥重要作用。

FGF21是FGF家族中的一员，是一种主要介导糖脂代谢的内分泌因子，在维持葡萄糖稳态、保护肝脏、心脏、肾脏和皮肤免受损害以及癌细胞生长方面发挥关键作用[17]。近年来，有证据表明FGF21在抗衰老过程中起着关键作用，FGF21治疗方案可改善多种与年龄相关的代谢性疾病的进程，包括肥胖、2型糖尿病、癌症、肾脏和心血管疾病等[18]。且过表达FGF21的转基因小鼠寿命比正常小鼠显著延长[19]。此外，FGF21通过调节沉默信息调节因子1(SIRT1)水平延缓内皮细胞的复制衰老[20]。FGF21还可以通过调节线粒体的生物发生，抑制血管紧张素诱导的人类大脑血管平滑肌细胞衰老[21]。然而FGF21在癌症发展过程中的研究报道较少。有研究发现，甲状腺癌患者组织中FGF21水平与癌症分期呈正相关，且与复发显著相关，重组FGF21可以通过激活癌细胞中的FGFR信号轴和EMT信号导致肿瘤具有侵袭性[22]。在本研究中，我们深入探讨了FGF21在卵巢癌中的表达水平和作用，结果发现FGF21在卵巢癌组织中表达量显著增加，且可以保护卵巢癌细胞免受氧化应激，降低卵巢癌细胞的凋亡率，发挥促癌作用。

在本研究中，TWIST2在卵巢癌组织和卵巢癌细胞中的表达量均显著低于癌旁组织和正常卵巢上皮细胞的表达量；过表达TWIST2可以显著促进卵巢癌细胞内的氧化应激并诱导卵巢癌细胞凋亡；此外，过表达TWIST2可以抑制FGF21蛋白及AMPK/mTOR通路相关蛋白的表达；进一步的研究结果表明FGF21介导的AMPK/mTOR通路参与TWIST2对卵巢癌细胞的作用途径。

综上所述，本研究证明TWIST2能够促进卵巢癌细胞氧化应激和凋亡，其作用机制是通过调控FGF21介导的AMPK/mTOR通路来实现的，这为临床上卵巢癌的诊断和治疗提供了理论依据。