早期异常卵裂不影响囊胚染色体整倍性

王江，熊顺，韩伟，付涛，魏彪，梁延峰，邹佳益，黄国宁*

(1.重庆市妇幼保健院生殖医学中心，重庆 400013；2.人类胚胎工程重庆市重点实验室，重庆 400013)

胚胎选择是体外受精(in vitro fertilization，IVF)技术的关键环节，选择具有最佳发育潜能的胚胎一直是胚胎学家致力于解决的难题。胚胎形态学评分已有几十年的历史，主要是通过评估卵裂球的数量、对称性以及碎片率来筛选胚胎，胚胎学家认为典型的卵裂模式使每轮有丝分裂后细胞数量翻倍，表现出这种分裂模式的胚胎更有可能经历了正常的有丝分裂，能够忠实地复制受精时的遗传物质。尽管一些新的方法如代谢物分析、呼吸率测定、基因表达和整倍体筛查等逐渐用于胚胎选择，然而形态学评分具有经济、快速、无创等优势仍为胚胎选择首选方法[1]。近年来新起的延时成像(time-lapse)技术能够对胚胎体外发育全过程进行监控，获取胚胎发育的动态信息。Time-lapse 在胚胎形态学评分的基础上，引入了胚胎分裂时间和异常分裂的概念，弥补了形态学评分的主观性和静态观察的局限性，能更加有效预测卵裂期胚胎发育潜能[2-3]。

Time-lapse技术的应用，使得胚胎发育动力学过程的更多细节被揭示，一些特殊的卵裂模式被胚胎学家认识、研究。常见的特殊卵裂模式有直接卵裂、逆卵裂、不规则卵裂。直接卵裂又分为：多极直接卵裂，即1个细胞直接分裂产生2个以上子细胞；快速直接卵裂，与直接卵裂相同之处在于每次分裂时产生2个以上子细胞，但快速直接卵裂的胚胎首先表现为正常的1-2细胞分裂，随后发生早成分裂产生3个或更多的子细胞，两次有丝分裂之间无分裂间期[4-5]。早期胚胎异常卵裂发生率高达40%[5]。研究发现异常卵裂会直接影响人类胚胎单个细胞的基因组，导致染色体丢失、嵌合，从而降低胚胎发育潜能，导致胚胎发育阻滞，囊胚形成率显著降低[6-7]。

众所周知，染色体非整倍性及早期植入胚胎中不正确的染色体拷贝数，是影响IVF成功的关键因素，它会导致植入失败、早期妊娠丢失或染色体异常妊娠持续进行，因而异常卵裂胚胎在临床上的应用一直困扰着胚胎学家。目前鲜有对异常卵裂囊胚整倍体率评估的相关研究报道。本研究旨在通过比较不同卵裂模式囊胚的整倍性来评估异常卵裂囊胚的应用价值，为异常卵裂胚胎的临床应用提供一个最佳的实验室策略。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析了2020年于重庆市妇幼保健院生殖医学中心接受植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing，PGT)患者夫妇的临床资料。

纳入/排除标准：根据中华医学会生殖医学分会的技术规范，所有进行PGT治疗的夫妇均具备PGT适应症[8]；排除自然周期PGT患者、单基因疾病植入前遗传学诊断(PGT-M)患者和睾丸取精患者。

本研究纳入符合条件的300个植入前非整倍体或染色体结构变异遗传学检测(PGT-A/SR)周期，共1 048枚活检囊胚。

二、研究方法

1.控制性促排卵：采用常规促排卵方案，包括长方案、拮抗剂和微刺激方案。结合血清性激素水平和B超监测卵泡发育情况，当2个及以上主导卵泡直径≥18 mm或者3个及以上卵泡直径≥17 mm时，注射HCG(珠海丽珠)并于35～36 h后超声引导下经阴道行穿刺取卵。

2.精液处理和受精培养：男方禁欲3～7 d，取卵日手淫取精，待精液液化后采用密度梯度离心法处理精液，将精液清洗后放于培养箱备用。ICSI受精：取卵后2 h将取出的卵丘-卵母细胞复合体置于40 U预热的透明质酸酶中用巴氏吸管轻柔地反复吹打，去除大部分颗粒细胞(透明质酸酶作用时间约20 s)。然后转入MOPS体外操作液，换用口径较细的巴氏吸管继续吹打去除多余的颗粒细胞并在脱颗粒细胞后3～6 h内完成ICSI受精，将受精卵转入G1(Vitrolife，瑞典)培养基中放入Time-lapse培养箱Embryoscope+(Vitrolife，瑞典)中培养，培养至第3天，将正常受精发育胚胎对应转入G2(Vitrolife，瑞典)培养基中继续培养。

3.胚胎活检和发育动力学参数标注：选择D5或D6发育至囊胚、Gardner评分[9]在3BC/3CB及以上的可用囊胚行滋养外胚层活检，活检细胞送公司(上海亿康医学检验公司，嘉宝仁和医疗科技有限公司)扩增后进行高通量测序诊断分析。同时标注活检胚胎发育到8细胞期的动力学参数和卵裂模式。标注时，参照“辅助生殖实验室技术”指南[10]，将第2天胚胎中直径大于45 μm的细胞质结构定义为细胞，最后依据不同的卵裂模式对胚胎整倍性进行分组比较。

4.囊胚分组：依据胚胎动态发育模式将其分为正常卵裂(n=826)和异常卵裂(n=167)组；异常卵裂中的直接卵裂又分为快速直接卵裂(n=87)和多极直接卵裂(n=41)组。

5.胚胎移植及妊娠判断：整倍体胚胎解冻后在腹部B超的引导下进行单囊胚移植。移植后14 d监测血HCG，28 d后行超声检查，见胎心搏动判断为临床妊娠。比较囊胚正常卵裂和异常卵裂的临床妊娠结局。

三、统计学处理

结 果

一、纳入周期及活检囊胚

本研究纳入的300个PGT-A/SR周期中PGT-A周期101个，PGT-SR周期199个，共获得1 048枚活检囊胚，55枚囊胚由于解冻卵母细胞、解冻胚胎或诊断失败导致数据信息缺失，最终993枚胚胎数据有效用于分析比较，其中826枚胚胎(83.18%，826/993)早期卵裂正常，167枚(16.82%，167/993)胚胎早期卵裂异常。993枚胚胎中，PGT-A周期胚胎数387枚，其中318枚胚胎(82.17%，318/387)早期卵裂正常；PGT-SR周期胚胎数606枚，其中508枚胚胎(83.82%，508/606)早期卵裂正常。本研究中，两种不同指征PGT活检囊胚卵裂模式无统计学差异(P>0.05)。

二、正常卵裂和异常卵裂囊胚组患者基础资料及PGT结果

两组之间患者年龄、体质量指数(BMI)、Gn用量以及临床用药方案、精液质量、PGT类型构成等均无统计学差异(P>0.05)；进一步比较二者染色体整倍性发现，两组间染色体整倍体率、非整倍体率和嵌合体率亦均无统计学差异(P>0.05)(表1)，早期异常卵裂并不影响形成囊胚的整倍性。

表1 正常卵裂与异常卵裂囊胚组患者基础资料及PGT结果

三、直接卵裂囊胚亚组患者基础资料及PGT结果

异常卵裂囊胚组中，直接卵裂囊胚128枚，其中快速直接卵裂囊胚有87枚(52.10%，87/167)、多极直接卵裂有41枚(24.55%，41/167)，快速直接卵裂囊胚比例高于多极直接卵裂囊胚。41枚多极直接卵裂囊胚中，仅有6枚发生于第1次有丝分裂异常，第1次有丝分裂多极直接卵裂囊胚发生率构成比低于第2次、第3次直接卵裂。同时，直接卵裂囊胚发育融合过程中至少有44枚观察到未融合游离细胞存在。此外，逆卵裂、复杂异常卵裂囊胚有39枚，其中有17枚表现为快速卵裂后伴随逆卵裂发生。

快速直接卵裂和多极直接卵裂两组之间患者年龄、BMI、Gn用量以及临床用药方案、精液质量、PGT类型构成等均无统计学差异(P>0.05)，两组囊胚整倍体率也无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 直接卵裂囊胚亚组患者基础资料及PGT结果

四、早期不同卵裂整倍体囊胚移植结局

正常卵裂与异常卵裂整倍体囊胚的临床妊娠及流产率均无显著性差异(P>0.05)(表3)，卵裂模式不影响整倍体囊胚临床结局。此外，13个直接异常卵裂整倍体囊胚移植周期中12个周期获得临床妊娠，不同异常卵裂(快速直接卵裂和多极直接卵裂)整倍体囊胚的临床妊娠率及流产率无明显差异(表3)。

表3 不同卵裂来源整倍体囊胚移植结局

讨 论

人类胚胎发育从受精卵开始，经历一系列有丝分裂事件分裂、分化形成，整个有丝分裂过程按特定的规律进行，严格遵循每轮有丝分裂后细胞数量翻倍(1-2-4-8细胞)。但胚胎体外有丝分裂实际过程中，会发生一些特殊分裂活动(异常卵裂)。这些特殊分裂通常导致胚胎遗传物质异常，严重影响胚胎的发育潜能[11]。McCollin等[6]的研究证实异常卵裂会直接影响人类胚胎单个细胞基因组，从而导致染色体丢失、嵌合和胚胎发育停滞。Lagalla等[7]研究了100多例异常卵裂胚胎，其中，有78.4%的胚胎因发育停滞或胚胎质量差而丢弃，并且卵裂期停滞的频率最高。这些发现与本研究中正常卵裂和异常卵裂囊胚构成比一致，本研究993枚活检囊胚中83.18%早期卵裂正常，仅有16.82%早期卵裂异常，异常卵裂胚胎囊胚形成率低。然而，通过进一步比较发现异常卵裂不影响囊胚染色体整倍性。胚胎发育过程中的自我筛选、自我校正和低比例嵌合可以解释这一现象：(1)自我筛选：异常胚胎发育阻滞淘汰了大部分染色体异常胚胎，筛选出部分具有发育潜能的二倍体胚胎。相关研究也证实了发育阻滞胚胎非整倍体率更高[11-12]。(2)自我矫正：异常卵裂主要导致子细胞遗传物质的增加或减少，这类异常子细胞在细胞压实过程中无法正常融合而被排除[7，12]。本研究观察到26.35%(44/167)早期异常卵裂胚胎在融合期有未融合的游离细胞，游离细胞最终以退化、空泡化、碎片化或直接排出等方式消失，也支持了胚胎自我矫正假说，即通过排除染色体异常细胞来实现染色体的整倍性。此外，第二种自我校正方式是三极分裂产生的三个子细胞中，有两个在分裂末期又发生融合，形成一个双核细胞[13]。本研究39枚有逆卵裂活动的胚胎中43.59%(17/39)经历了一个1-3-2的快速卵裂活动。(3)异常细胞以嵌合方式存在：嵌合体发生在15%～90%的卵裂期胚胎中，当前诊断技术无法检测出低比例嵌合，嵌合位置、比例和所涉及的染色体决定胚胎临床结局，因而嵌合体胚胎也有机会发育成健康胎儿，目前临床上已有嵌合体胚胎移植健康胎儿出生报道[14-15]。

本研究还比较了两种直接卵裂模式与囊胚整倍体率的相关性，结果表明不同直接卵裂模式不影响囊胚整倍性。活检囊胚中快速直接卵裂和多极直接卵裂的比例分别是52.10%、24.55%。有文献报道，直接卵裂和多极直接卵裂的发生概率分别是18.0%、8.0%[5，16]，由此猜想快速直接分裂对胚泡形成的破坏似乎更小。它与多极有丝分裂不同的是，快速分裂产生的细胞系并不都是亚二倍体，基因的分割只会发生在两个产生的子细胞中，仍会留下一个二倍体细胞继续正常发育和囊胚形成，而多极卵裂胚胎的发育能力取决于错误分裂发生的阶段，异常卵裂发生越早，染色体非整倍性越高。如果第一次有丝分裂发生直接卵裂可能会产生三个核型明显完全不同的细胞，胚胎发育成整倍体的几率小[17]。本研究由41枚多极卵裂发育而来囊胚中，仅6枚多极卵裂发生在第1次有丝分裂，胚胎发育潜能差，与文献报道一致。因此区分这两种类型的直接卵裂很重要，它们可能发育至囊胚的几率不同，这对细胞期移植胚胎选择具有指导意义，但两种卵裂来源囊胚整倍体率及发育潜能无明显差异。由于样本量限制，这一结论有待进一步验证。

异常卵裂发生机制尚不清楚。Boveri等[18]发现中心体周期调节受损可导致多极纺锤体的形成，可能是直接卵裂的发生机制。中心体调节功能受遗传、环境和精子等因素影响。精子质量是影响异常纺锤体形成的一个因素，因为精子中心体控制受精后第一次有丝分裂[19]。例如精子氧化应激反应、DNA碎片等都会增加直接卵裂和逆卵裂发生风险[20]。有文献报道逆卵裂的发生与促排方案相关[21]；母体年龄也会影响卵裂模式[22]。此外，遗传因素也会影响卵裂活动，有文献报道母体plk4中心体调控因子变异很可能使胚胎发生减数分裂和有丝分裂错误[23]。然而，本研究由于样本量限制，纳入了199个PGT-SR周期，该周期患者主要存在一方或双方染色体易位问题。文献回顾，目前未见染色体易位患者胚胎异常卵裂率高于染色体正常人群的相关报道，从本研究结果部分可知PGT-SR组胚胎异常卵裂率与PGT-A组没有明显差异。由此看来，胚胎异常分裂与有丝分裂相关细胞器及相关调控组件关系更密切。

虽然早期异常卵裂胚胎染色体异常率高，发育能力差，但本研究通过比较囊胚期不同卵裂模式胚胎的整倍体率发现，早期异常卵裂并未显著影响到囊胚染色体整倍性。众所周知，非整倍体在早期人类胚胎中普遍存在，是导致妊娠失败的主要因素，本研究通过比较正常卵裂和异常卵裂整倍体囊胚的移植结局，目前未发现二者之间存在显著性差异，因而异常卵裂囊胚与正常卵裂囊胚可能具有相似的临床价值。该研究结果与Ozbek等[24]报道的不一致，有必要扩大样本量进一步研究早期异常卵裂对囊胚移植结局影响；然而，Ozbek等[24]认为异常卵裂囊胚整倍体率更高，值得斟酌。

异常卵裂会直接影响人类胚胎单个细胞基因组，从而导致胚胎发育阻滞，囊胚形成率降低。但是，我们的研究发现，早期异常卵裂胚胎发育到囊胚期其染色体整倍性及发育潜能与正常卵裂囊胚并没有明显差异。因此，胚胎移植、冻存时，优先选择卵裂正常的细胞期胚胎；对于异常卵裂胚胎建议行囊胚培养后选择利用，具有与正常卵裂胚胎相似的临床价值。