雌、孕激素受体在反复移植失败伴慢性子宫内膜炎患者子宫内膜中的表达及意义

武露明，张虹，沈豪飞，王奕翔，贾天玉，张学红，王一青*

(1.兰州大学第一临床医学院，兰州 730000；2.兰州大学第一医院生殖医学中心 甘肃省生殖医学与胚胎重点实验室，兰州 730000；3.兰州大学第一医院病理科，兰州 730000)

随着医疗水平的快速发展，辅助生殖技术可以满足大部分不孕不育患者的生育要求，但仍有40%的患者不能受孕，其中包括反复移植失败(recurrent implantation failure，RIF)[1]。RIF一直是困扰临床医生和胚胎学家的难题，多个周期的移植失败会给患者带来心理压力和经济负担等诸多问题。研究发现慢性子宫内膜炎(chronic endometritis，CE)与RIF相关，CE在RIF人群中发病率为7.7%～56.1%[2-5]。CE是一种持续存在于子宫内膜局部的慢性炎症，临床常表现为无症状，少数表现为异常子宫出血、盆腔疼痛、性交困难和白带增多等[6]。CE诊断的金标准为子宫内膜间质浆细胞浸润，CD138是浆细胞的标记物，现在已经成为筛查CE的可靠标志物[7]，临床针对可疑CE患者常采用CD138免疫组化检查。子宫内膜类固醇激素水平在胚胎着床中起到关键作用，激素不足将导致胚胎着床失败。目前研究雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)表达于宫腔粘连患者子宫内膜的情况较多[8-9]，但有关CE的研究较少。本研究通过检测CE患者内膜组织中ER与PR的表达情况并分析其相关性，以期对临床治疗提供新的参考。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2018年1月至2019年6月就诊于兰州大学第一医院生殖医学中心的RIF患者80例(RIF组)和同期就诊、暂未接受胚胎移植助孕治疗的80例不孕患者(对照组)的临床资料。RIF组的纳入标准：40岁以下的患者；接受3次及以上胚胎移植周期(包括新鲜及冷冻移植周期)；累积移植至少4枚卵裂期优质胚胎而未能获得临床妊娠。对照组的纳入标准：40岁以下从未接受过胚胎移植周期的不孕患者。排除标准：绝经及围绝经期女性；凝血功能障碍；认知功能障碍；子宫或附件切除女性。

RIF组中接受ER和PR受体检测的患者共34例，根据是否患有子宫内膜炎(CE)再次分组，分别为CE组(n=14)与非CE组(n=20)。CE的诊断参考其宫腔镜下特点：(1)子宫内膜局灶或弥漫性充血(草莓征)；(2)子宫内膜间质水肿(与月经周期不符的内膜增厚、发白、表面不规则)；(3)子宫内膜微小息肉样改变(息肉直径小于1 mm)。

二、主要试剂和仪器

CD138鼠抗人单抗(MAB-0200)、PR兔抗人单抗(Kit-0013)、ER兔抗人单抗(Kit-0012)、即用型快捷免疫组化MaxVisionTMHRP试剂盒(抗鼠/兔，Kit-5030)及DAB显色试剂盒(DAB-0031)均购自福州迈新生物技术开发有限公司；组织脱水机(TP1020，徕卡，德国)，石蜡包埋机(KEDEE-KD-BMII，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)、石蜡切片机(RM2245，徕卡，德国)，罗氏全自动免疫组化仪 (BenchMark XT，瑞士)，显微镜及图像采集系统(IX73，OLYMPUS，日本)。

三、研究方法

1.宫腔镜检查及子宫内膜收集：两组患者均采用德国史托斯宫腔镜观察月经干净后3～7 d内的子宫内膜情况，并刮取部分子宫内膜送检。本研究中所涉及操作均征得患者同意并签署知情同意书。

2.免疫组化法检测子宫内膜组织中CD138、ER和PR的表达情况：宫腔镜术后刮取部分子宫内膜标本，经多聚甲醛固定，常规脱水、包埋、切片(4 μm)后，放入罗氏全自动免疫组化仪进行免疫组化染色，其中一抗孵育时间60 min，二抗孵育时间30 min，所用抗体均为即用型抗体。检测判断标准采用Kaku等[7]提出的：10个非重叠高倍镜视野中至少检出3个浆细胞定义为阳性；检出浆细胞小于3个则为阴性。CD138阳性率=子宫内膜组织CD138阳性患者例数/该组患者总例数×100%。

ER或PR染色为棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞，常位于细胞核。每张片子随机取5个视野，放大400倍计数每张镜片阳性细胞的百分率并进行评分，其中阳性细胞百分率1%～10%为1分；11%～25%为2分；26%～50%为3分；51%～75%为4分；大于75%为5分；每张切片亦根据细胞染色强度进行评分，分别记为1、2、3、4、5分。每张切片的总评分=染色强度评分+阳性细胞百分率评分/2。结果判定均由同一名病理科医师进行。

四、统计学方法

结 果

一、两组患者的一般情况比较

两组患者的年龄、不孕年限、月经周期、体重指数(BMI)、孕次、产次和双侧基础窦卵泡计数(AFC)比较差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者的一般情况比较(-±s)

二、免疫组化法检测两组患者子宫内膜组织中CD138的表达情况

免疫组化染色发现，RIF组患者子宫内膜组织中CD138阳性率为17.5%(14/80)，对照组中CD138阳性率2.5%(2/80)，两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。

A：CD138表达呈阳性子宫内膜间质(箭头所示为阳性细胞)；B：CD138表达呈阴性的子宫内膜间质；C：两组患者子宫内膜CD138阳性率比较。与对照组比较，*P<0.05图1 两组患者子宫内膜组织间质中CD138的表达情况及比较(免疫组化，×400)

三、RIF中CE组与非CE组患者子宫内膜中ER和PR的表达情况

RIF组中接受ER和PR受体检测的患者共34例，根据是否患有CE分为CE组(n=14)与非CE组(n=20)。免疫组化染色发现，在子宫内膜的间质及腺体中均存在ER和PR表达(图2)。统计结果显示，CE组与非CE组中ER的表达有显著性差异(P<0.05)；而PR的表达组间比较无显著性差异(P>0.05)(图3)。

A：非CE组ER的表达情况；B：CE组ER的表达情况；C：非CE组PR的表达情况；D：CE组PR的表达情况图2 CE组与非CE组患者子宫内膜中ER和PR的表达情况(免疫组化，×400，黑色箭头表示腺体，红色箭头表示间质)

与非CE组比较，*P<0.05图3 CE组与非CE组患者ER和PR表达的评分比较

讨 论

子宫内膜受到雌孕激素的调控，其中雌激素对内膜上皮细胞的增殖、形态变化、细胞分化和分泌起到重要作用。ER的表达在子宫内膜增生早期达到高峰，在子宫内膜增生晚期和分泌早期略有下降。ER是雌激素影响子宫血管重建和内膜再生的桥梁。有研究发现在不明原因的不孕患者中子宫内膜ER和PR的阳性表达显著减少(P<0.05)，认为ER和PR表达下降会导致子宫内膜成熟障碍及内膜对胚胎植入的容受性改变[10]。Guleria等[11]在一项前瞻性研究中发现，放置宫内节育器患者的子宫内膜ER和Ki-67蛋白表达显著降低(P<0.05)，但血清雌二醇和孕酮水平无显著变化(P>0.05)，提示血清性激素水平不一定能准确反映子宫内膜激素受体状态。

有研究表明，子宫内膜微生态失调是IVF、RIF及复发性流产的重要原因之一[12]。子宫内膜微环境影响子宫内膜激素受体状态，在正常月经周期中腺体和基质对类固醇调节的敏感性是不同的。有研究认为20%的CE患者子宫内膜腺腔和间质中有中性粒细胞聚集，弥漫性炎症的存在可能干扰子宫内膜腺体和基质细胞ER的表达[13]。此外，越来越多的证据表明，生殖道炎性反应在宫腔粘连的发病中亦扮演了重要角色。早在19世纪80年代，就有学者提出慢性或亚急性子宫内膜炎是宫腔粘连形成的危险因素[14]。Czernobilsky[15]认为，宫腔粘连是子宫内膜在慢性炎症作用下形成的纤维化型子宫内膜炎。而宫腔粘连也是引起RIF的一个重要原因。近年来有研究亦表明，宫腔粘连合并CE的患者粘连复发率显著高于非CE组(44.8% vs. 20.8%)[16]，提示宫腔粘连患者同样伴有子宫内膜微环境的改变。国内一些学者的研究也侧面验证了这一观点，他们发现宫腔粘连患者子宫内膜组织中ER表达水平显著高于对照组(P<0.05)，PR在子宫内膜组织中的表达与对照组则没有显著性差异(P>0.05)，而且ER表达水平与宫腔粘连术后雌激素治疗的疗效呈正相关[9，17]。

本研究基于Liu等[18]的研究结果，依据CD138免疫组化染色结果将RIF组患者根据是否患有CE进一步分为CE组与非CE组，并对子宫内膜分别进行ER和PR免疫组化染色发现，CE组患者子宫内膜中间质与腺体中的ER表达水平显著高于非CE组(P<0.05)，但两组患者子宫内膜间质及腺体中PR的表达比较并无显著性差异(P>0.05)。Gibreel等[19]发现，不孕患者行子宫内膜搔刮术后加用雌孕激素联合治疗对CE有效，ER高表达的CE患者对雌激素更加敏感，行子宫内膜搔刮术可以导致内膜局部的损伤，联合应用雌孕激素可以促进子宫内膜蜕膜化，从而提高胚胎移植移植率。

综上所述，RIF与CE具有相关性，针对有3次及以上胚胎移植周期失败的患者建议行免疫组化染色，以排除子宫及内膜因素对胚胎着床的影响；且ER在CE患者子宫内膜间质中高表达，提示对于CE患者同时检测ER的表达情况对于后续制定个性化激素治疗方案有益。但本研究尚存在一定的局限性，首先本研究未检测药物治疗后ER和PR的表达情况；其次样本量过少。后期尚需要大样本的多中心研究进一步探讨ER和PR在CE患者子宫内膜中的表达，同时应了解炎性状态下内膜功能层及基底层ER和PR的表达情况。