二甲双胍调控自噬减轻高糖诱导滋养层细胞损伤的实验研究

相 萌， 张旭东， 赵 巧， 赵宗霞

(1.西安医学院临床医学院妇产科教研室， 陕西 西安 710021 2.西安医学院临床医学院拉吉姆实验室， 陕西 西安 710021) 3.西安医学院第二附属医院妇产科， 陕西 西安 710038)

妊娠糖尿病(Gestational Diabetes Mellitus，GDM)是妊娠期最常见糖代谢疾病，影响3%～30%的妊娠期妇女[1]。GDM可能会导致胎盘发育不良、促进流产和胎儿畸形等妊娠不良结局，这可能与高血糖作用相互联系。胎盘是正常妊娠及胎儿生长发育的重要场所，其正常生理功能与绒毛膜滋养层细胞密切相关[2]。证据显示，GDM患者的自噬水平明显增强，且高葡萄糖水平能够增强滋养层细胞的自噬和凋亡[3]。宋鸿碧等[4]研究显示，二甲双胍联合胰岛素泵治疗GDM患者，能够有效控制血糖、减少并发症，但二甲双胍对高糖诱导的滋养层细胞损伤情况的影响及与自噬水平的关系尚不明确。因此本研究在体外培养人绒毛膜滋养层HTR8-SVneo细胞，建立高糖损伤模型，探讨二甲双胍对高糖诱导人滋养层细胞的增殖、凋亡、自噬的影响及其作用机制，为将二甲双胍应用于GDM治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1主要材料与仪器

1.1.1主要材料:人绒毛膜滋养层HTR8-SVneo细胞(ml053596)购自上海酶联生物科技有限公司；盐酸二甲双胍片(B14202003084)购自中美上海施贵宝制药有限公司；RPMI 1640培养基(PM150110)、RPMI 1640无糖培养基(PM150122)、胎牛血清(164210-100)、青霉素-链霉素溶液(双抗)(PB180120)、D-葡萄糖溶液(PB180418)购自武汉普诺赛生命科技有限公司；0.25%胰蛋白酶消化液(T1350)、噻唑蓝(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)(M8180)、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-fluorescein Isothiocyanate/Propidium Iodide，Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒(CA1020)、RIPA裂解液(R0020)、逆转录试剂盒(T2210-200T)、Trizol试剂盒(R1100)、ECL发光液(PE0010)购自北京Solarbio公司；磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde Phosphate Dehydrogenase，GAPDH)兔抗人多克隆抗体(PA1-16777)、自噬相关基因7(autophagy related gene7，ATG7)兔抗人多克隆抗体(PA5-17216)、Beclin-1兔抗人多克隆抗体(PA5-96649)、核孔蛋白(Nucleoporin 62，p62)兔抗人多克隆抗体(PA5-27247)、微管相关蛋白轻链3 Ⅰ/Ⅱ(Microtubule-associated Protein Light Chain 3 Ⅰ/Ⅱ，LC3Ⅰ/Ⅱ)兔抗人多克隆抗体(PA5-109226)、山羊抗兔IgG(H + L)二级抗体(A32731)购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2主要仪器:二氧化碳细胞培养箱(Herocell 180)购自上海润度生物科技有限公司；PCR仪(T100)购自美国Bio-Rad公司；酶标仪(HBS-1093C)购自南京德铁实验设备有限公司；倒置显微镜购自(MA100N)购自日本Nikon；流式细胞仪(CytoFLEX)购自美国Beckman公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养:将HTR8-SVneo细胞用RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清、1%双抗、5.5 mmoL/L葡萄糖)，在37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞融合度达90%左右，0.25%胰酶消化、传代，收集细胞用于后续实验。

1.2.2MTT实验

1.2.2.1高糖诱导模型[5]:将1.2.1培养的HTR8-SVneo细胞随机分为对照组和高糖组，分别含有D-葡萄糖终浓度：对照组(5.5mmoL/L)；高糖组(10、15、20、30、40mmoL/L)。将各组细胞接种于96孔板(4.5×104个/孔)，每组设置6个复孔，并设置调零孔(加入等体积PBS)，培养24h，弃去上清液，加入100μL/孔二甲基亚砜，37℃摇床震荡10min，用酶标仪上测定波长570nm时各孔吸光值(OD值)。计算各组细胞存活率，存活率(%)=(实验孔OD值-调零孔OD值)/(对照组OD值-调零孔OD值)，取50%存活率左右的高糖浓度建立高糖诱导HTR8-SVneo细胞损伤模型。

1.2.2.2二甲双胍作用后细胞活性检测:收集1.2.1HTR8-SVneo细胞，随机分为对照组(5.5mmoL/L D-葡萄糖)、模型组(30mmoL/L D-葡萄糖)、二甲双胍I组(30mmoL/L D-葡萄糖+1mmoL/L 二甲双胍)、二甲双胍Ⅱ组(30mmoL/L D-葡萄糖+5mmoL/L 二甲双胍)、二甲双胍Ⅲ组(30mmoL/L D-葡萄糖+15mmoL/L 二甲双胍)。分别使用含有对应二甲双胍浓度的无血清培养基培养HTR8-SVneo细胞24h，每组设置6个复孔，按照1.2.2.1实验方法检测各组细胞存活率。

1.2.3Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡:按照1.2.2.2分组方法，将各组HTR8-SVneo细胞接种于6孔板(1.2×106个/孔)，每组设置6个复孔，培养24 h，用不含EDTA的胰酶消化收集各组细胞，PBS清洗2次，离心(1500 r/min，5 min)收集细胞沉淀，500μL Binding Buffer重悬后，依次加入10 μL Annexin V-FITC和PI，混匀、4℃避光静置20 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。凋亡率(%)=凋亡早期细胞比例+凋亡晚期细胞比例。

1.2.4RT-qPCR实验:按照Trizol试剂盒说明书提取1.2.3各组HTR8-SVneo细胞总RNA，逆转录后进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃预处理1min，95℃ 15s，60℃ 30s，共40个循环，收集荧光信号。以GAPDH为内参，利用2-△△Ct法计算Beclin-1 mRNA及ATG7 mRNA基因相对表达量。Beclin-1、ATG7及GAPDH引物序列由上海生工生物工程有限公司设计合成，见表1。

1.2.5蛋白免疫印迹分析实验:收集1.2.3各组HTR8-SVneo细胞，加入RIPA裂解液(200μL/孔)低温裂解30min，BCA法测定总蛋白量。取等量蛋白经SDS-PAGE电泳，转膜，用5%脱脂牛奶室温封闭2h，加入稀释的一抗Beclin-1、ATG7、p62(1∶1000)、LC3Ⅰ/Ⅱ(1∶500)、GAPDH(1∶2000)，4℃孵化过夜，添加稀释的二抗(1∶5000)孵化2h，洗膜，使用ECL试剂盒显色，凝胶成像仪成像，利用Image J扫面处理灰度值，分析目标蛋白表达情况。

2 结 果

2.1高糖诱导对HTR8-SVneo细胞增殖抑制作用:与对照组相比，高糖组(15、20、30、40mmoL/L)HTR8-SVneo细胞存活率依次降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组HTR8-SVneo细胞存活率

2.2二甲双胍对高糖诱导的HTR8-SVneo细胞存活率影响:与对照组相比，模型组HTR8-SVneo细胞存活率显著降低(P<0.05)；与模型组相比，二甲双胍I组、二甲双胍Ⅱ组及二甲双胍Ⅲ组HTR8-SVneo细胞存活率依次升高(P<0.05)，呈剂量依赖性。见表3。

表3 二甲双胍对高糖诱导的HTR8-SVneo细胞存活率影响

2.3二甲双胍对高糖诱导的HTR8-SVneo细胞凋亡影响:与对照组相比，模型组HTR8-SVneo细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与模型组相比，二甲双胍I组、二甲双胍Ⅱ组及二甲双胍Ⅲ组HTR8-SVneo细胞凋亡率依次降低(P<0.05)，呈剂量依赖性。见图1、表4。

图1 二甲双胍对高糖诱导的HTR8-SVneo细胞凋亡的影响

表4 二甲双胍作用后高糖诱导的HTR8-SVneo细胞凋亡率变化

2.4二甲双胍对各组细胞自噬标记物LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62表达影响:与对照组相比，模型组HTR8-SVneo细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高(P<0.05)，p62蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，二甲双胍I组、二甲双胍Ⅱ组及二甲双胍Ⅲ组HTR8-SVneo细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值依次降低(P<0.05)，p62蛋白表达水平依次升高(P<0.05)，呈剂量依赖性。见图2，表5。

图2 各组HTR8-SVneo细胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62蛋白表达电泳图

表5 二甲双胍对各组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ p62表达影响

图3 各组HTR8-SVneo细胞中Beclin-1、ATG7蛋白表达电泳图

表6 二甲双胍对各组细胞Beclin-1 ATG7 mRNA及蛋白表达影响

2.5二甲双胍对各组HTR8-SVneo细胞Beclin-1、ATG7 mRNA及蛋白表达的影响:与对照组相比，模型组HTR8-SVneo细胞Beclin-1、ATG7 mRNA及蛋白表达量显著升高(P<0.05)；与模型组相比，二甲双胍I组、二甲双胍Ⅱ组及二甲双胍Ⅲ组Beclin-1、ATG7 mRNA及蛋白表达量依次降低(P<0.05)，呈剂量依赖性。见图3，表6。

3 讨 论

GDM患者在妊娠期间的糖耐量会显著降低，主要表现为高血糖症和碳水化合物代谢紊乱，发病率高达17.7%[6]。母亲血糖升高会导致胎儿胰岛素分泌增加，从而引起巨人症、剖宫产的风险，此外，GDM易使后代换上心血管病、肥胖和糖尿病等疾病。目前，GDM的治疗有饮食管理、运动治疗和药物治疗等，可以减少但不能预防GDM不良后果，因此开发新的治疗方式具有临床研究意义[7]。本研究发现，与对照组相比，高糖各组HTR8-SVneo细胞存活率依次降低，当D-葡萄糖浓度大于30mmoL/L，细胞损伤严重(大于50%)，不利用后续实验的进行，因此本实验选择30mmoL/L作为建立高糖诱导滋养层细胞损伤模型的最佳浓度。

二甲双胍是临床应用广泛的口服降糖药物之一，已被证实可以预防或延迟患有糖尿病的孕妇发展为Ⅱ型糖尿病[8]。二甲双胍在治疗GDM中发挥重要作用，其联合胰岛素能够良好的控制妊娠期妇女的血糖水平。Gray等[9]调查显示，二甲双胍治疗GDM有利于母亲和胎儿长期安全。Vega等[10]研究发现，二甲双胍预处理能够防止胰岛素诱导的滋养层细胞存活率降低和细胞凋亡。本结果显示，与对照组相比，模型组HTR8-SVneo细胞存活率显著降低、凋亡率显著升高，提示损伤模型建立成功；与模型组相比，二甲双胍I组、二甲双胍Ⅱ组及二甲双胍Ⅲ组HTR8-SVneo细胞存活率依次升高、凋亡率依次降低，呈剂量依赖性，提示二甲双胍能够降低高糖诱导的滋养层细胞损伤程度，推测二甲双胍可能对高糖诱导的滋养层细胞发挥保护作用。

自噬是细胞维持稳态的动态过程，与胎盘发育过程中合体滋养层细胞分化调控相关。LC3作为最早被发现的自噬标记物，其前体产生的LC3Ⅰ与自噬小体结合形成LC3Ⅱ，是细胞自噬的关键指标[11]。P62是自噬底物，参与细胞自噬，与细胞自噬程度呈负相关[12]。本研究结果显示，与模型组相比，二甲双胍Ⅰ组、二甲双胍Ⅱ组及二甲双胍Ⅲ组HTR8-SVneo细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值依次降低，p62蛋白表达水平依次升高，提示二甲双胍能够抑制高糖诱导的人绒毛膜滋养层细胞自噬水平。纪璐璐等[13]研究证实，高糖环境绒毛膜滋养层细胞的自噬能够增强凋亡，因此推测二甲双胍可能通过抑制高糖诱导的滋养层细胞自噬，抑制凋亡，减轻细胞损伤。

Beclin-1、ATG7是自噬相关蛋白，能够诱导自噬的形成，研究证实，Beclin-1与ATG7在细胞自噬过程存在相互依赖关系[14]。本研究结果显示，与模型组相比，二甲双胍Ⅰ组、二甲双胍Ⅱ组及二甲双胍Ⅲ组Beclin-1、ATG7 mRNA及蛋白表达量依次降低，呈剂量依赖性，提示二甲双胍可能通过Beclin-1/ATG7途径，抑制高糖诱导的绒毛膜滋养层细胞自噬水平。在人脐静脉内皮细胞中，二甲双胍能够通过下调自噬，发挥高糖条件下的内皮保护作用；此外，自噬相关蛋白Beclin-1及ATG7在非二甲双胍治疗的Ⅱ型糖尿病患者中表达增加，我们推测，二甲双胍能够通过抑制高糖诱导的人绒毛膜滋养层细胞过度自噬，发挥保护作用，该过程可能与Beclin-1/ATG7途径密切相关。

综上所述，二甲双胍可通过抑制高糖诱导的人绒毛膜滋养层细胞自噬，从而减轻高血糖对人绒毛膜滋养层细胞的损伤，可能与Beclin-1/ATG7途径有关，为二甲双胍用于临床治疗GDM的作用机制提供理论参考。本实验仅在体外对二甲双胍的作用机制进行了初步研究，将联合体内小鼠模型和临床研究进行更深入的探索。