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榆栀止血颗粒含药血清对异位子宫内膜间质细胞PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响

2021-02-27刘艳杰

河北医学 2021年2期
关键词:含药异位症异位

刘艳杰, 杨 阳

(1.郑州大学第一附属医院妇科, 河南 郑州 450000 2.南京医科大学附属南京医院妇科, 江苏 南京 210006)

子宫内膜异位症是多发于育龄妇女的妇科疾病,特征为子宫内膜组织(包括腺体、间质)异位种植到子宫腔被覆黏膜及子宫以外的部位,可引发疼痛、月经失调、盆腔包块,甚至不孕等症状或体征[1]。虽然子宫内膜异位症属于良性疾病,但由于其具有种植广泛、侵袭性强、易复发等肿瘤类似生物学行为的特点,严重影响患者的身心健康和生活质量。目前,关于子宫内膜异位症发生的学说研究较多,但其分子病理机制尚不完全明确,目前多认为子宫内膜增殖、迁移、黏附、侵袭是子宫内膜异位症发病过程的关键步骤[2]。第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)是具有蛋白与脂质磷酸酯酶活性的抑癌基因,与多种肿瘤的发生发展密切相关,可通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidyl inositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信号转导途径,调控细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭等过程[3]。研究表明,子宫内膜异位症发生与PTEN/PI3K/AKT信号通路有关[4]。榆栀止血颗粒是一种固经止血、滋阴清热的中成药,成份复杂,常用来治疗月经过多、经期延长。子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)是子宫内膜的主要组成部分,本研究将通过研究榆栀止血颗粒含药血清对异位ESCs细胞增殖、侵袭及PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响,以期为榆栀止血颗粒用于治疗子宫内膜异位症提供一定参考。

1 材料与方法

1.1实验动物:8周龄SPF级雄性SD大鼠,体质量250g左右,购自上海吉辉实验动物饲养有限公司生产许可证号:SCXK(沪)2017-0012。

1.2试剂与仪器:胎牛血清(货号:FBS500-S)购自澳大利亚AusGeneX公司;榆栀止血颗粒(国药准字:Z20130019)购自山东新时代药业有限公司;CCK-8试剂(货号:CK-04)购自日本同仁化学研究所;Matrigel基质胶(货号:356234)购自美国BD公司;结晶紫(货号:0528-100G)购自美国Amresco公司;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)试剂盒(货号:K1002S)购自美国Promega公司;PTEN、GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;PTEN抗体、p-AKT抗体、AKT抗体、GAPDH抗体(货号:ab267787、ab8933、ab64148、ab181602)购自abcam公司;PI3K抗体、p-PI3K抗体(货号:bs-0128R-2、bs-5538R-2)购自上海恒斐生物科技有限公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(货号:0295G-HRP)购自美国santa公司;恒温培养箱(型号:MIR-162-PC/MIR-262-PC)购自日本松下公司;酶标仪、化学发光成像系统(型号:MODEL550、ChemiDocXRS)购自美国Bio-Rad公司;显微镜(型号:CX31)购自日本Olympus公司;荧光定量PCR仪(ABI 7500)购自美国Applied Biosystems公司。

1.3实验方法

1.3.1榆栀止血颗粒含药血清的制备:24只SD大鼠随机分为榆栀止血颗粒低剂量组、中剂量组、高剂量组和空白对照组,每组6只,分别给予各组大鼠榆栀止血颗粒药液(1g/mL、3g/mL、5g/mL)2.5mL及生理盐水2.5mL灌胃,连续7d,末次给药2h后,麻醉大鼠并通过腹主动脉采血,37℃放置3h后,4℃静置过夜,3000r/min离心15min,取上清液,0.22μm微孔滤膜除菌,将每组大鼠的血清混合,分为榆栀止血颗粒低、中、高剂量血清和空白血清。-20℃保存备用。

1.3.2异位ESCs细胞的分离、培养及分组:取异位子宫内膜新鲜组织,无菌生理盐水清洗,将组织剪成0.1~1mm3碎块,加入含1%胶原酶和100μg/mL DNA酶的培养液,置于37℃、5% CO2培养箱中消化1~1.5h,用100目不锈钢筛网过滤未消化组织,800r/min离心去上清,加入完全培养液将沉淀重悬为5×105个/mL的细胞悬液,接种在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,细胞融合率达到80%左右时,用胰蛋白酶消化、传代培养。取对数期异位ESCs细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔培养板,每孔100μL,分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,分别加空白血清、榆栀止血颗粒低剂量血清、榆栀止血颗粒中剂量血清和榆栀止血颗粒高剂量血清。

1.3.3CCK-8法检测各组异位ESCs细胞增殖情况:将1.3.2中各组异位ESCs细胞培养48h,加入CCK-8试剂后继续培养2h,使用全自动酶标仪于波长450nm处检测各孔吸光度(optical density,OD)值。

1.3.4Transwell法检测各组异位ESCs细胞侵袭情况:用无血清培养基稀释Matrigel基质胶(1:8),向每个Transwell小室中加50μL,37℃ 1h凝固。用无血清培养液将1.3.2中各组异位ESCs细胞稀释为2.5×105个/mL的细胞悬液,以200μL接种于Transwell小室上层,下室中加入500μL 10%胎牛血清的培养液,37℃、5% CO2培养箱中孵育24h,擦去未侵袭细胞,用4%多聚甲醛固定10min穿膜细胞,PBS洗涤,0.5%结晶紫染液染色20min。在显微镜下随机选取6个视野,统计200倍镜下的穿膜细胞数目,计算平均值。

1.3.5qRT-PCR法检测各组异位ESCs细胞中PTEN mRNA表达情况:将1.3.2中各组异位ESCs细胞培养48h,收集细胞,使用TRIzol试剂提取总RNA,逆转录合成cDNA,采用qRT-PCR法检测PTEN mRNA表达水平,内参基因为GAPDH。反应程序:95℃预变性10min;95℃变性10s,55℃退火35s,72℃延伸1min,循环40次。PTEN上游引物:5'-ACCAGAGA CAAAAAGGGAGTA-3',下游引物:5'-ACCACAAACTGAGG ATTGCA-3';GAPDH上游引物:5'-GAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3',下游引物:5'-GCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。Ct值为扩增产物的荧光信号达到临界阈值时对应的循环数,相对表达量以2-ΔΔCt法表示。

1.3.6蛋白印迹(western blot,WB)法检测各组异位ESCs细胞中PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达情况:将1.3.2中各组异位ESCs细胞培养48h,收集细胞,提取各组细胞总蛋白并定量。电泳分离等量蛋白质并转至PVDF膜上,用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1h,分别加入PTEN抗体、p-PI3K抗体、PI3K抗体、p-AKT抗体、AKT抗体、GAPDH抗体(1∶500),4℃孵育过夜,TBST洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶5000),室温孵育1h,免疫反应化学发光法显色,Tanon 600图像分析系统拍摄图像并分析条带灰度,目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。

2 结 果

2.1各组异位ESCs细胞增殖情况:与对照组相比,低、中、高剂量组异位ESCs细胞OD值显著降低(P<0.05);随着榆栀止血颗粒含药血清剂量升高,异位ESCs细胞OD值逐步递减(P<0.05),见表1。

表1 各组异位ESCs细胞OD值比较

2.2各组异位ESCs细胞侵袭情况:与对照组相比,低、中、高剂量组异位ESCs细胞侵袭细胞数显著降低(P<0.05);随着榆栀止血颗粒含药血清剂量升高,异位ESCs细胞侵袭细胞数逐步递减(P<0.05),见图1、表2。

图1 各组异位ESCs细胞侵袭情况(×200)

表2 各组异位ESCs细胞侵袭细胞数比较

2.3各组异位ESCs细胞中PTEN mRNA表达情况:与对照组相比,低、中、高剂量组异位ESCs细胞中PTEN mRNA表达水平显著升高(P<0.05);随着榆栀止血颗粒含药血清剂量升高,异位ESCs细胞中PTEN mRNA表达水平逐步递增(P<0.05),见表3。

表3 各组异位ESCs细胞中PTEN mRNA表达水平比较

2.4各组异位ESCs细胞中PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达情况:与对照组相比,低、中、高剂量组异位ESCs细胞中PTEN蛋白表达水平显著升高(P<0.05),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达水平显著降低(P<0.05);随着榆栀止血颗粒含药血清剂量升高,异位ESCs细胞中PTEN蛋白表达水平逐步递增(P<0.05),p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达水平逐步递减(P<0.05),见图2、表4。

图2 各组异位ESCs细胞中PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达情况

表4 各组异位ESCs细胞中PTEN p-PI3K PI3K p-AKT AKT蛋白表达水平比较

3 讨 论

子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性疾病,是造成妇女盆腔痛、生育力低下、具有恶性肿瘤高发风险的重要原因,严重威胁育龄期妇女的健康[5]。近年来,子宫内膜异位症发病有上升趋势,发病率高达15%,进行妇科手术的患者中被发现同时合并子宫内膜异位症的患者占5%~15%。现阶段,临床上通常将手术疗法与药物疗法联合用于子宫内膜异位症治疗,以多种药用植物为主的中药疗法或植物提取物在子宫内膜异位症中的治疗应用中受到广泛关注[6]。

榆栀止血颗粒主要由地榆炭、墨旱莲、炒栀子组成,具有清热、凉血、调经止痛的功效,常用于治疗血热证所致月经过多、经期延长等症,可伴见口干心烦、尿赤便结、舌红、苔黄、脉滑数等。本研究结果显示,与对照组相比,低、中、高剂量组异位ESCs细胞OD值、侵袭细胞数显著降低;随着榆栀止血颗粒含药血清剂量升高,异位ESCs细胞OD值、侵袭细胞数逐步递减,提示榆栀止血颗粒含药血清可呈剂量依赖性抑制异位ESCs细胞的增殖与侵袭,可能在治疗子宫内膜异位症中具有一定作用,但具体机制尚不清楚。

子宫内膜异位症发生与异位ESCs细胞的增殖、侵袭等密切相关,如何有效积极防治异位ESCs细胞的增殖、侵袭已成为预防子宫内膜异位症关键所在[7,8]。PTEN是一个抑癌基因,不仅参与肿瘤发生发展,对子宫内膜异位症的发生发展也有一定抑制作用。叶妮等[9]研究表明,PTEN的降低是EMs的发病机制之一,通过上调PTEN mRNA及蛋白表达可使异位内膜出现凋亡性病理改变,而不影响在位内膜的病理结构。PI3K/AKT信号通路与细胞内信号转导有关,是人体内基础信号通路之一,参与细胞发育、增殖、凋亡与侵袭等过程[10]。王静等[11]研究发现,萝卜硫素可通过PI3K/Akt信号通路降低腹腔子宫内膜异位症大鼠病灶体积。张亚萍等[12]研究亦发现,蠲痛饮治疗子宫内膜异位症,抑制上皮间质细胞活性,促进细胞凋亡,可能是通过下调PI3K/Akt /mTOR通路蛋白的表达发挥作用的。Zhang等[4]研究表明,miR-26a通过PTEN/PI3K/AKT途径促进奶牛子宫内膜上皮细胞增殖并诱导基质细胞凋亡。本研究结果显示,随着榆栀止血颗粒含药血清的使用及剂量升高,异位ESCs细胞中PTEN mRNA及蛋白表达水平显著升高,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达水平显著降低,提示榆栀止血颗粒可影响PTEN/PI3K/AKT通路,可能通过促进PTEN转录翻译,抑制PI3K、AKT磷酸化蛋白表达,进而抑制异位ESCs细胞的增殖与侵袭。

综上所述,榆栀止血颗粒含药血清可抑制异位ESCs细胞的增殖与侵袭,并影响PTEN/PI3K/AKT信号通路的激活,可能对治疗子宫内膜异位症有一定帮助,但还需要进一步深入研究。

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