伐地那非对豚鼠药物性聋听功能及耳蜗毛细胞形态学的影响

梁 媛, 黄跃雁, 郭 霞, 刘淑红， 刘吉娜， 曹 静

(承德医学院附属医院耳鼻喉科, 河北 承德 067000)

药物性聋是指因抗肿瘤类药物、抗生素、水杨酸钠等药物应用过程中或应用后发生的感音神经性耳聋，其中氨基糖苷类抗生素如庆大霉素、卡那霉素等是最常见的耳毒性药物。由于庆大霉素等所导致的药物性聋严重者可引起终身听力损伤，因此，一直以来人们对庆大霉素等耳毒性病理机制的研究从未停止，目前机制阐述主要有自由基损伤学说、代谢抑制学说、钙离子紊乱学说等，但确切机制至今仍不清楚，也无特效防治手段或药物。Jaumamm等[1]首次描述了PDE5蛋白在耳蜗中内毛细胞(IHC)、外毛细胞(OHC)和螺旋神经节神经元(SGNs)的表达及其与环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶-1(Prkg1)的部分共定位，表明在这些细胞中存在PDE5-cGMP-Prkg1信号传导，这一研究为药物性聋临床防治又提供了新的路径。伐地那非作为一种5-磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂，是通过改变NO/cGMP代谢途径发挥抵制血小板凝聚、促进血管收缩等诸多作用，其已经在性功能障碍、心血管系统、肺动脉、等方面取得了公认肯定的疗效，但在内耳方面尚无系统研究。本实验通过建立庆大霉素致豚鼠药物性聋动物模型，以伐地那非作为实验药物进行药物性聋干预研究，探讨其在庆大霉素致豚鼠耳蜗功能损伤中所发挥的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料:实验动物由河北医科大学实验动物中心提供，选择条件：雄性豚鼠30只；8周龄大小；健康杂色；饲养场所安静，温度控制在22℃左右，湿度控制在50%左右；耳廓反射灵敏；体重245～310g。应用数字表法将符合条件的雄性豚鼠30只分为三组，分别是空白对照组、模型对照组以及治疗组，每组豚鼠各10只。三组豚鼠均采用戊巴比妥钠(剂量：40mg/kg)进行腹腔麻醉，起效后在实验豚鼠双侧皮层听区硬膜外进行手术，埋植记录电极，术毕应用牙科水泥进行固定，整个手术过程严格执行无菌操作。三组豚鼠术后稳定7d，而后开始实验。

1.2主要试剂和仪器:实验药物：伐地那非，生产商为Bayer Pharma AG，批号为H090491；硫酸庆大霉素，生产商为华北制药集团制剂有限公司，规格为80mg/支，国药准字号H13020452；戊巴比妥钠，生产商为广州化学制剂厂，生产批号为20131212。实验仪器：听觉脑干诱发电位仪，生产商为丹麦丹迪公司，型号为Keyponit型4通道；扫描电子显微镜，生产商为日本日立公司，型号为S-3500N SEM。

1.3方法:第一阶段(建模)：模型对照组、治疗组豚鼠均给予腹腔注射硫酸庆大霉素120mg·kg-1·d-1，连续2周。第二阶段(药物实验)：建模完成后，模型对照组豚鼠给予腹腔注射生理盐水，剂量为4mL/kg，每日注射1次，连续注射4周。治疗组豚鼠给予腹腔注射伐地那非，剂量为1.0mg/kg，用生理盐水稀释后注射剂量为4mL/kg，每日注射1次，连续注射4周。整个实验过程中空白对照组不给予特殊处理。

1.4听性脑干反应(ABR)的测量:三组雄性豚鼠限制于测试笼之中，均保持清醒状态，放在符合国家相关标准的隔声电屏蔽室之内。分别在豚鼠测试耳同侧乳突部位放置参考电极，在测试耳对侧的乳突部位放接地电极。打开听觉脑干诱发电位仪，滤波带通设置为30～3000Hz，扫描时间设置为15ms，叠加设置为1024次。选用方波脉冲刺激声(波宽0.1ms，频率设为20Hz)，ABR阈值记录值选择当Ⅲ波刚出现时候的刺激强度。测量时间点：建模前1d、建模开始后每1周，空白对照组也在相应时间点进行测量。

1.5扫描电镜观察:每组豚鼠随机选择5只，均取左耳耳蜗，进行扫描电镜观察。处理过程：在最后一次ABR测试过后，将2%戊巴比妥钠按30mg/kg腹腔注射麻醉豚鼠，取出听泡，在蜗尖处钻孔，镫骨脱位；使用2.5%的戊二醛进行前固定；使用浓度为0.1moL/L的磷酸盐缓冲液进行三次的漂洗，每次大约洗10min；采用浓度为1.0%的锇酸固定60min后，再次使用磷酸盐缓冲液进行漂洗，而后乙醇梯度脱水、干燥，最后金属镀膜；应用扫描电镜，观察、记录实验豚鼠螺旋器细胞超微结构的变化。

2 结 果

2.1三组豚鼠ABR阈值的变化比较:在实验过程中，空白对照组10只豚鼠的听觉持续保持正常，ABR阈值无明显变化。模型对照组、治疗组的豚鼠在庆大霉素注射2周以后，ABR阈值均出现显著性上移，与建模前1d的ABR阈值比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)，这两组豚鼠建模后的ABR阈值比较，无统计学差异(P>0.05)，提示听觉损害建模成功。药物实验阶段，治疗组、模型对照组建模结束后给予相应药物注射治疗，在治疗后的各个时间点，治疗组的ABR阈值均明显低于同期的模型对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。治疗组从治疗第1周开始，ABR阈值持续呈现下降，模型对照组从建模结束后的4周内，ABR阈值仍持续性上升，并且第4周测得的ABR阈值显著高于与第1周，差异具有统计学意义(P<0.05)。通过重复测量方差分析，组间、时间在三组豚鼠ABR阈值中存在明显的主效应(P<0.05)，组间与时间也存在明显的交互作用,见表1。

表1 三组豚鼠不同时间点的ABR阈值声压级，dB)

2.2扫描电镜观察:空白对照组耳蜗的外毛细胞形态表现为排列整齐，界限清楚，提示形态正常(图1所示)。模型对照组外毛细胞呈现出听毛紊乱，或融合，或缺失，提示形态出现明显的损伤(图2所示)。治疗组观察到外毛细胞形态结构基本上正常，只有听毛出现轻度的倾倒、融合现象，提示耳蜗损伤程度比较轻微(图3所示)。

图1 空白对照组—耳蜗毛细胞形态(外毛细胞×800)

2.3不良反应:此次实验的整个过程，没有实验豚鼠发生死亡，也没有实验豚鼠发生耳内感染、行走异常等不良症状，给予不同药物注射后实验豚鼠也没有发生与药物相关的不良反应。

图2 模型对照组—耳蜗毛细胞形态(外毛细胞×800)

图3 治疗组—豚鼠耳蜗毛细胞形态(外毛细胞×800)

3 讨 论

感音神经性聋是耳科学领域中的常见病，发病率较高，且在逐年增加，其中临床药物是感音神经性聋最为常见的致病因素，在这些临床药物中，氨基糖甙类抗生素由于使用较为广泛，其导致的感音性耳聋更为多见。氨基糖苷类抗生素是广谱杀菌药，广泛的应用于临床治疗，但是其在内耳的内外淋巴液内可有高浓度蓄积，会产生明显的耳毒性，从而损伤哺乳动物耳蜗的感音结构以及神经节细胞，造成听力损害，这是慎重使用该类药物的主要原因[2]。尽管如此，对临床部分疾病来说，氨基糖甙类抗生素尤其是庆大霉素却一直是首选之药，甚至是必选之药。此外，多重耐药菌不断地出现，也使得氨基糖甙类抗生素重新被临床医生所重视。从不同视角度探索氨基糖苷类抗生素所致的耳毒性机理以及寻找预防治疗药物的努力一直没有停止过，但均不尽人意。

目前许多研究发现[3]，毛细胞内Ca2+超载与庆大霉素所致药物性聋密切相关。当庆大霉素进入内耳后并被毛细胞所吸收，使细胞内Ca2+浓度异常增加，而它的过度增加可以对细胞造成许多危害，如神经递质释放的抑制、离子代谢的紊乱、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成的障碍等，但细胞内Ca2+浓度升高的最大潜在危机是Ca2+作为一种激活剂可以启动钙激活蛋白的活动，不可避免地导致转录因子的崩溃，从而引起细胞凋亡，造成不可逆性的听力损伤。另外，有些研究的结果显示，由庆大霉素所导致的药物性聋后，耳蜗中一氧化氮合酶(NOS)的活性出现增强，而且增强幅度与听阈升高幅度有着明显的相关性。这一研究结果可能提示，在庆大霉素所导致的药物性聋的病理过程中，耳蜗中的NO扮演着重要角色。很多生理学证据证实内耳中存在NO/cGMP途径，并且提示此途径能够通过调节细胞内Ca2+浓度进而调控内耳的微循环和生理功能，尤其是在听觉传导、内环境的稳定及微循环改善方面[4]。在哺乳动物的耳蜗内，Hensen细胞之间存在着大量而丰富的缝隙连接，这些缝隙连接可让相关信息在皮质类固醇之间进行快速地交换，从而促进离子在整个耳蜗中的循环。当庆大霉素进入细胞内后，异常增高的ATP使得Hensen's细胞内的Ca2+浓度过度增加，从而阻断缝隙连接之间的耦联，改变了耳蜗的正常功能。OHCs的低渗应激能够增加细胞内Ca2+和一氧化氮产生，同时，在OHCs的相同亚细胞区域中检测到PDE5和Prkg1非常接近，这是OHC中存在cGMP信号传导复合物的要求。Matsunobu等通过研究发现，利用NO/cGMP路径能够降低由ATP所引发的Hensen细胞内Ca2+浓度[5]，从而解除或者抑制Hensen细胞间的缝隙连接通路，最终有益于维护耳蜗的正常生理功能。另一方面，ATP利用P2γ受体使得血管内皮细胞释放内皮舒张因子(EDRF)，从而引起血管的扩张，而后者证明就是NO。实际上NO具有双重功用。当NO表达水平为正常生理剂量时，其可一定程度地抑制毛细胞钙超载，从而保护耳蜗的正常生理功能，而当NO表达水平异常升高后，其可导致了蜗中毛细胞缺失，甚至还能够诱导、促进神经细胞等发生凋亡。从这个角度来看，在耳蜗中可能存在着ATP/Ca2+-NO/cGMP通路并通过这个通路来调节耳蜗功能。

本实验发现，在实验过程中，空白对照组10只豚鼠的听觉持续保持正常，ABR阈值无明显变化。另外二组雄性豚鼠在注射庆大霉素之后，ABR阈值发生普遍性的上移。在治疗4周以后，模型对照组豚鼠ABR阈值仍在49分贝以上，我们认为，此组豚鼠已经发生永久性ABR阈移。与上述相反的是，治疗组10只豚鼠，ABR阈移变化相较于模型对照组有明显减轻，特别是在治疗4周后，治疗组ABR阈值已经接近药物致聋前的阈值。本次实验电镜观察结果显示，模型对照组毛细胞损伤最为严重，治疗组损伤程度显著低于前者。由此可以看出，伐地那非能够减轻庆大霉素所致的听力损害，具有保护豚鼠耳蜗毛细胞的功用。

伐地那非属于选择性PDE5抑制剂，其可抑制海绵体内PDE5，从而增强NO并调节Ca2+浓度。cGMP作用于特异性受体蛋白，包括cGMP依赖性蛋白激酶(Prkg，也称为cGK或PKG)，表达Prkg神经元和非神经元细胞类型，包括豚鼠耳蜗支持细胞和螺旋神经节神经元(SGNs)，伐地那非通过PDE水解第二信使分子cGMP终止信号。国外研究表明，在耳蜗的毛细胞之内，存在PDE5-Prkg1-cGMP-PARP这种信号肽[6]。PARP1属于广泛性表达的一种DNA缺口末端传感器，它使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为底物催化PAR加入受体蛋白，特别是组蛋白、转录因子和PARP本身，从而致DNA断裂而大量激活PARP，促进基因转录、复制，以及DNA碱基切除修复。与此同时，DNA的损伤、PARP1异常激活会引起NO的毒性作用，而且随着NAD+、ATP的消耗怠尽而引发细胞死亡。在这种情况下，PDE5抑制剂不仅能够提升cGMP信号传导的保护作用，而且又不会引发NO的潜在破坏性，特别是因为PARP活化也可能由cGMP直接引起[7]。通过国外学者的研究显示了PDE5抑制剂诱导的PAR浓度升高的促生存效应，这可能也反映了PARP的抗衰老能力[8]。

本实验结果提示，在所设实验条件之下，伐地那非可一定程度地治疗豚鼠耳蜗药物性听功能损害，减轻耳蜗药物性毛细胞损伤。