升降散加减方治疗IgAN大鼠作用机制探讨

张圆圆 靳培培 郭登洲

IgA肾病(immunoglobulin a nephropathy，IgAN)是指以IgA或以IgA为主的免疫复合物沉积于肾小球系膜区，临床表现以血尿，伴或不伴蛋白尿为主的病理综合征[1]。IgAN治疗方面，西医多以血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂控制血压、减少尿蛋白，应用糖皮质激素、免疫抑制剂等治疗为主，而传统中医虽对IgAN没有明确的记载，但根据其临床表现将其归于“尿血”“腰痛”“水肿”“虚劳”等疾病的范畴，以其独特的理论作指导来辨证论治本病，如《血证论·尿血》中提到“膀胱与血室并域而居，热入血室则蓄血，热结膀胱则尿血，尿乃水分之病，而亦干动血分者，以与血室并居，故相连累也”。可见湿热常见于IgAN的发生发展过程中。本实验通过观察疏通三焦、清热利湿理论指导的升降散加减方对IgAN大鼠24小时尿蛋白定量(24 hours urinary total protein，24h-UTP)，血清肌酐(serum creatinine，Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清白蛋白(albumin，ALB)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、半乳糖缺乏的IgA(galactose deficient IgA，Gd-IgA)表达水平的影响以及IgAN大鼠肾脏组织病理的变化，来了解升降散加减方可能的作用机制，为临床治疗本病提供实验理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与药物

于河北医科大学动物实验中心购进48只雄性SD大鼠，健康清洁级，体重(150±10)g，动物合格证编号：1805044，许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。

升降散加减方组成：僵蚕15 g、蝉蜕15 g、杏仁12 g、陈皮12 g、茯苓15 g、炒莱菔子12 g、黄芪15 g，购自河北省中医院中药房，以上药物先经蒸馏水浸泡2小时，煎煮2次(40分钟/次)后，过滤，合并滤液加热蒸发，依据陈奇大鼠与人药物剂量折算方法再分别浓缩至含生药1 g/mL水提液，制成药液备用，每次根据老鼠体重灌服。盐酸贝那普利片由北京诺华制药有限公司提供。

1.2 试剂与部分仪器

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)，购自北京索莱宝科技有限公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS),购自北京索莱宝科技有限公司；四氯化碳(CCl4),购自北京索莱宝科技有限公司；蓖麻油，购自北京索莱宝科技有限公司。

尿液分析仪(美国CLINITEK50)(全自动洗板机8×12，美国)、全自动生化分析仪(Japan，Sysmex HEMIX-180)、离心机(上海安亭，TDL-5-A)、实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD CFX96)、酶标仪(Thomer Fisher MK FC)、电热恒温水箱(600型，天津泰斯特)等。

1.3 造模与分组给药

将SD大鼠随机分为正常组12只、造模组36只，进行1周适应性喂养，采用联合BSA灌胃+尾静脉注射LPS+皮下注射CCl4、蓖麻油的免疫复合的方法建立实验性IgAN模型，方案如下：口服免疫原BSA剂量较常用剂量增加1倍，以600 mg/kg隔天灌胃，持续6周；CCl4注射方式由既往的腹腔注射改为皮下注射，皮下注射蓖麻油0.5 mL+CCl40.10 mL，每周1次，持续9周，并联合运用LPS，分别于第6、8周尾静脉注射LPS 0.05 mg。模型制作成功后，将造模组大鼠随机分成中药组、西药组和模型组各12只。中药组每日灌服中药，西药组每日灌服1.8 mg/kg盐酸贝那普利，模型组、正常组给予等量蒸馏水灌胃，每日1次，共8周。

1.4 采集标本与检测指标

1.4.1 24h-UTP检测 分别于实验第1、9、15、19周留取24小时尿液，用全自动生化分析仪检测，并记录好相关数据。

1.4.2 血清指标检测 实验19周后，禁食12小时，禁水4小时，腹腔注射麻醉后(10%水合氯醛3.5 mL/kg)，采用股动脉采血，运用全自动生化分析仪测定Scr、BUN、ALB等指标；运用ELISA法检测血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA的含量。

1.4.3 肾组织镜检及免疫荧光检查 大鼠股动脉取血后，立即将大鼠肾脏分离，将切取的肾组织用4%的多聚甲醛液进行固定，用于苏木精—伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)、马松染色(Masson staining，Masson)、过碘酸雪夫氏染色(schiff periodic scid shiff，PAS)、过碘酸—银—乌洛托品(Perioddic acid silver meth enamine，PASM)常规染色的光镜制备使用；将一部分肾脏组织迅速制成冰冻切片，用于进行免疫荧光检测；取大小为1 mm×1 mm的肾组织于4%的戊二醛固定液中用以进行透射电镜样本制备。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠的一般情况

正常组大鼠毛色光亮，精神、摄食、饮水均正常，体重逐渐增加；模型组、中药组、西药组大鼠在造模阶段出现毛色亮度降低，精神不振，进食减少，体重增加缓慢；而药物干预治疗后，中药组、西药组大鼠上述症状有所恢复。

2.2 各组大鼠24h-UTP检测结果

实验第1周，各组实验大鼠尿蛋白均为阴性，组间比较无统计学差异(P>0.05)。实验第9周，与正常组相比，模型组、中药组、西药组实验大鼠24h-UTP均增高，差异有统计学意义(P<0.05)。第15、19周，与正常组相比，模型组实验大鼠24h-UTP升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，中药组、西药组实验大鼠24h-UTP均降低，差异有统计学意义(P<0.05); 与西药组相比，中药组大鼠24h-UTP 无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组IgAN大鼠24h-UTP的变化比较

2.3 各组大鼠血清指标检测结果

与正常组相比，各组实验大鼠血清中Scr、BUN、ALB的含量无统计学差异(P>0.05)；与模型组相比，中药组、西药组实验大鼠血清中Scr、BUN、ALB的含量无统计学差异(P>0.05);与西药组比较，中药组实验大鼠血清中Scr、BUN、ALB的含量无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组IgAN大鼠血清Scr、BUN和ALB的比较

2.4 光镜观察各组大鼠肾脏结构

正常组大鼠肾小球等形态结构均正常，基底膜、系膜细胞、间质细胞及胞外基质未见异常病理改变，无间质炎性细胞浸润，血管腔清晰；模型组大鼠肾小球呈代偿扩张和萎缩病变，系膜细胞和内皮细胞呈中重度增生，系膜基质表现为弥漫性增宽增厚，肾小管间质炎性细胞浸润，呈间质纤维化，毛细血管袢阻塞；西医组、中药组大鼠光镜下肾组织病理改变与模型组相似，但较模型组病理损伤较轻。见图1～4。

2.5 电镜观察各组大鼠肾脏系膜区

正常组大鼠肾小球系膜区清晰，无电子致密物，基质分布均匀，足突排列有序，大小相等，基底膜厚度一致；模型组系膜细胞增生，基质增多，系膜区散在高密度电子致密物沉积，足细胞可见足突节段性融合、绒毛变性；西药组、中药组大鼠电镜下见少量电子致密物沉积系膜区，足突轻度融合或不明显，肾小球系膜细胞轻度增生，西药组、中药组大鼠电镜下病理损伤较模型组有所减轻。见图5。

注： A:正常组;B:模型组;C:西药组;D:中药组。

注： A:正常组;B:模型组;C:西药组;D:中药组。

注： A:正常组;B:模型组;C:西药组;D:中药组。

注： A:正常组;B:模型组;C:西药组;D:中药组。

注： A:正常组;B:模型组;C:西药组;D:中药组。

注： A:正常组;B:模型组;C:西药组;D:中药组。

2.6 免疫荧光法观察各组大鼠肾脏肾小球系膜区

正常组大鼠无免疫复合物沉积于肾小球系膜区；模型组大鼠有团块状免疫复合物沉积于肾小球系膜区；西药组、中药组大鼠有不同程度的免疫复合物沉积于肾小球系膜区，但沉积量较模型组少。见图6。

2.7 ELISA法检测各组大鼠血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA的含量

与正常组相比，模型组大鼠血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA含量均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，西药组、中药组大鼠血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA含量均下降,差异有统计学意义(P<0.05)；与西药组相比，中药组大鼠血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组IgAN大鼠血清中TGF-β1、IL-6 和Gd-IgA的比较

3 讨论

3.1 检测指标选择依据

IgAN发病机制复杂，而免疫致病机制为本病的重要致病机制。IgAN的首要发病机制为IgA1异常糖基化[2]。IgA1分子正常的情况下有独特的铰链区结构，在铰链区中有多个苏氨酸、丝氨酸残基，此为O糖基化的连接位，IgA1分子O糖基化过程中，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)在N-乙酰半乳糖胺转移酶的作用下与丝氨酸、苏氨酸连接形成O糖基化的基本结构，半乳糖(Gal)在C1GalT1和分子伴侣Cosmc的催化作用下与GalNAc连接，N-乙酰神经氨酸在α-2，6唾液酸转移酶(ST6GALNAC2)或α-2，3唾液酸转移酶(ST3GAL)的作用下与GalNAc或Gal连接形成糖链[3]。而在产生IgA1的细胞中，GalNAc的唾液酸仅由ST6GALNAC2催化。IgA1分子的O-连接聚糖形成过程中，若IgA1分子铰链区O -糖基化程度降低，缺乏半乳糖的GalNAc上直接连接唾液酸，此时形成的多聚糖无法被修饰则产生了Gd-IgA1，而Gd-IgA1与IgAN的发生相关[4]。Gd-IgA1可使IgA1易于自身聚集，或形成免疫复合物沉积于肾小球系膜区，此为IgA的主要发病原因[5]。Robert等[6]认为只要影响到糖基化的酶，就可能影响IgA1糖基化，C1GalT1、ST6GALNAC2即为上述过程中的关键酶。影响这2种酶表达或活性的因素，即能使 C1GalT1活性低并且(或者)使ST6GALNAC2活性增强就会使IgA1异常糖基化。最新研究发现， TGF-β通过下调C1GalT1和Cosmc的 mRNA水平来影响二者的产生[7]。IL-6在IgAN 患者的血清中含量升高，会降低Cosmc和C1GalT1的表达，进而影响IgA1的糖基化[8-9]。此外，IL-6还能增加ST6GalNAcⅡ 的表达。

3.2 疏通三焦，清热利湿理论依据

IgA肾病在中医上属于“水肿”“血尿”等范畴，根据陈香美等[10]制作的大样本IgAN患者中医证候的流行病学调查显示IgAN患者主要以“湿热”“血瘀”两种证候为主(31.6%、28.9%)。时振声教授[11]也认为湿热是导致肾病发生的主要病因病机。人体水液代谢与肺、脾、肾、三焦关系密切，肺主通调水道；脾主运化水液；肾主水，调节体内水液的潴流、分布、排泄，三焦是水液运行的通道，其中脾居中焦，主运化水液，是水液代谢的枢纽。当各种病理因素，如七情内伤等致使脾的运化受损，则会引起水液停聚为湿邪，此时若机体正气亏虚感受外邪则会化生湿热。湿为阴邪，其性重浊黏滞，易袭阴位，故而侵犯下焦，肾为五脏之下极，故最易受之。此外，湿邪日久亦可化热，而湿热可循水液运行三焦，引起肺、脾、肾三脏功能失调:湿热壅塞上焦，则肺失宣发肃降，气化失司，故见肢体水肿；湿热壅塞中焦，脾失健运，中焦运化水液失司，引起恶性循环，加重湿热；湿热壅塞下焦，肾失封藏，五脏六腑所藏之精不固而下泄，故可见蛋白尿，湿热蕴结于膀胱，灼伤脉络可见血尿。

郭登洲教授结合多年临床治疗经验及目前研究共识，认为湿热为本病的重要病因[12-14]，而“血瘀”贯穿于IgA肾病的发生、发展整个过程中。其病机为脾胃虚弱导致水液运化失司，水液停聚，日久化热，从而影响脾胃的正常运化，致使湿热更胜；湿热下注，累及下焦，水热互结，损伤肾脏，使血溢出脉外，出现血尿，日久致使肾脏出现病理变化；同时湿热日久，耗伤阴液，阴亏血耗，则血行迟缓，瘀血内生；“湿热”“血瘀”两者相互影响，共同促进疾病的发展，加重肾脏组织的损伤。因此笔者团队认为“湿热内蕴，瘀血阻络”是IgAN基本证候。因此治疗上当以疏通三焦，清热利湿为原则，方用升降散加减方使三焦通畅，湿热得以清利，从而使疾病得到有效控制以期达到治愈。

3.3 升降散加减方用药分析

升降散加减方由僵蚕、蝉蜕、杏仁、陈皮、茯苓、炒莱菔子、黄芪组成。其中僵蚕气轻味浮，可祛风散结，宣发气机，开其湿热郁结；僵蚕、蝉蜕，生发清阳以宣发诸身气机，使郁结得开，气机畅达；杏仁开上焦肺气，肺宣湿开，则热随湿去；以陈皮通调中焦气机，使气机调达，给湿邪以去处；茯苓、炒莱菔子利湿通腑导下焦湿热，使下焦通畅；黄芪补气之不足，诸药合用疏利三焦、清利湿热。气充则化湿利水，正气足而邪不可干。课题组运用升降散加减方治疗IgAN，对于减轻血尿、蛋白尿确有实效，在此基础上进行了前期临床观察，结果表明升降散加减方有助于减低终点事件的发生，减少血尿、蛋白尿，治疗IgAN疗效确切[15]，这也进一步证明了湿热在IgAN发病过程中起重要作用。

综上，疏通三焦、清热利湿理论指导下的升降散加减方可减轻IgAN大鼠肾脏的病理变化，其降低尿中蛋白及减轻肾脏病理变化的效果与贝那普利相当。可见本方对IgAN大鼠有治疗作用，其作用机制可能与降低血清中TGF-β1、IL-6、Gd-IgA的含量有关。