探讨变色酸2R－亮绿在肾活检组织染色中的应用

姚 伦，刘树军，高 丹，娄 岩，韩 梅＊

（1.吉林省人民医院凯旋院区综合内科，吉林长春130052；2.吉林大学第二医院）

探讨变色酸2R－亮绿在肾活检组织染色中的应用

姚 伦1，刘树军2，高 丹2，娄 岩2，韩 梅2＊

（1.吉林省人民医院凯旋院区综合内科，吉林长春130052；2.吉林大学第二医院）

目前肾活检病理特殊染色是确诊肾脏疾病病理类型的主要手段，Masson三色染色法是肾活检病理特殊染色主要方法之一，主要反映肾小球内免疫复合物沉积及胶原纤维增生等情况，有效反映肾小球内免疫复合物沉积的形态和特征，对肾脏疾病病理诊断起到决定性的作用［1］。在临床实践中发现变色酸2R－亮绿法不仅能达到传统Masson三色染色法的效果，同时也缩短了染色时间，简化了染色步骤。本文将变色酸2R－亮绿法所示肾小球内免疫复合物沉积的形态和部位与免疫荧光和电镜（TEM）比较，以验证变色酸2R－亮绿法在肾活检组织染色中应用的可行性和可重复性，以评价其临床推广意义。

1 材料与方法

1.1 材料 选取吉林大学第二医院肾病内科2012年1月至2014年12月，肾穿刺活检组织标本842例，每例标本分成光镜、免疫荧光、透射电镜（TEM）三部分。光镜标本制作成2μm病理切片，行变色酸2R－亮绿染色；免疫荧光标本制作成3μm免疫荧光切片，行IgG、IgA、IgM、C1q、C3、C4、Fib、HB－sAg、HBcAg、HBeAg染色；TEM标本送于北京大学第一院电镜室，行醋酸双氧铀－柠檬酸铅染色和TEM检查。染色结果均由经验丰富的病理医师进行评价和诊断。

1.2 染液配制方法 变色酸2R－亮绿染液：磷钨酸3.2g，冰醋酸4ml，变色液2R2.0g，亮绿1.7g，蒸馏水400ml。

1.3 染色方法 1）石蜡切片常规脱蜡至水；2）媒染剂（10%三氯醋酸、10%重铬酸钾等量混合）15min，流水冲洗；3）Harris苏木精染液3min，流水冲洗；4）1%盐酸－酒精分化数秒，流水冲洗；5）弱氨水返蓝数秒，流水冲洗；6）变色酸2R－亮绿染液数秒；7）0.2%冰醋酸水溶液数秒；8）95%乙醇快速脱水；9）无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。

2 结果

2.1 IgA肾病（IgAN）免疫荧光、TEM、光镜比较

免疫荧光证明IgA（＋＋）、C3（＋）呈团块状沉积于肾小球系膜区（图1，A）。TEM检查证明肾小球系膜细胞和基质轻度增生，系膜区和副系膜区块状电子致密物沉积，基底膜无明显病变，上皮足突节段融合（图1，B）。变色酸2R－亮绿染色法显示肾小球系膜区有红色物质沉积，即免疫复合物所沉积部位，系膜区及毛细血管襻被染成绿色，其中绿色的系膜区较正常的肾小球宽大，提示系膜基质增生（图1，C）。变色酸2R－亮绿法所示IgA肾病免疫复合物沉积的形态和部位与免疫荧光和TEM一致。

图1 IgAN（Lee分级2级） A：免疫荧光IgA（＋＋）呈团块状沉积于肾小球系膜区；B：TEM显示电子致密物系膜区和副系膜区块状沉积；C：变色酸2R－亮绿染色法显示免疫复合物沉积于肾小球系膜区，系膜基质增生

2.2 膜性肾病（MN）免疫荧光、TEM、光镜比较

免疫荧光证明IgG（＋＋＋）、C3（＋＋）呈颗粒状沿肾小球毛血管襻呈均匀沉积（图2，A）。TEM检查证明肾小球基底膜大部分增厚，节段钉突样增生，上皮下多数块状电子致密物沉积，上皮足突广泛融合（图2，B）。变色酸2R－亮绿染色法所示上皮下有红色物质沉积，即免疫复合物沉积部位，同时绿染基底膜均质增厚（图2，C）。变色酸2R－亮绿法所示MN免疫复合物沉积的形态和部位与免疫荧光和TEM一致。

图2 MN（Ⅱ期） A：免疫荧光IgG（＋＋＋）呈颗粒状沿肾小球毛血管襻呈均匀沉积；B：TEM肾小球基底膜节段钉突样增生，上皮下多数块状电子致密物沉积；C：变色酸2R－亮绿染色法显示免疫复合沉积于肾小球上皮下，基底膜均匀增厚

2.3 狼疮性肾炎（LN）免疫荧光、TEM、光镜比较

免疫荧光证明IgG（＋＋）、IgA（＋＋）、IgM（＋）、C1q（＋＋）、C3（＋＋）、C4（＋＋）及Fib（＋）在肾小球毛细血管襻呈颗粒状沉积（图3，A）。TEM检查证明肾小球内节段性内皮下、上皮下少量电子致密物沉积，上皮足突广泛融合（图3，B）。变色酸2R－亮绿法所示LN内皮下有及上皮下红色免疫复合物沉积，部分呈“白金耳”样损害（图3，C）。变色酸2R－亮绿法所示LN免疫复合物沉积的形态和部位与免疫荧光及TEM结果一致。

2.4 乙肝相关性肾炎（HBVN）免疫荧光、TEM、光镜比较

免疫荧光证明IgG（＋＋）、IgA（＋＋）、C1q（＋＋）、C3（＋＋）、HBsAg（＋＋）、HBcAg（＋＋）呈颗粒状均匀沉积于肾小球毛细血管襻，少许呈团块状在系膜区沉积（图4，A）。TEM检查证明肾小球上皮下、基底膜内、节段性系膜区及副系膜区块状电子致密物沉积，基底膜大部分不规则增厚，上皮足突广泛融合（图4，B）。变色酸2R－亮绿法所示HBVN内皮下有弥漫性的红色物质沉积，系膜区有少许红色物质沉积，即免疫复合物沉积的部位，绿染肾小球系膜基质和基底膜提示系膜基质节段性轻度增生及基底膜增厚（图4，C）。变色酸2R－亮绿法所示HBVN免疫复合物沉积的形态和部位与免疫荧光及TEM一致。

图3 LN（IV－G（A）） A：免疫荧光IgG（＋＋）呈颗粒状沿肾小球毛细血管襻沉积；B：TEM肾小球内节段性内皮下、上皮下少量电子致密物沉积，上皮足突广泛融合；C：变色酸2R－亮绿法显示毛细血管襻内皮下有及上皮下免疫复合物沉积，部分呈“白金耳”样损害。

图4 HBVN A：免疫荧光HBcAg（＋＋）呈颗粒状均匀沉积于肾小球毛细血管襻，少许呈团块状在系膜区沉积；B：TEM肾小球上皮下、基底膜内、节段性系膜区及副系膜区块状电子致密物沉积，上皮足突广泛融合；C：变色酸2R－亮绿法显示肾小球内皮下及系膜区有均有免疫复合物沉积，系膜基质轻度增生、基底膜增厚

2.5 膜增生性肾小球肾炎（MPGN）免疫荧光、TEM、光镜比较

免疫荧光证明IgG（＋＋）、C3（＋＋）、C1q（＋＋＋）、IgM（＋＋）呈颗粒状沿肾小球毛血管襻呈均匀沉积（图5，A）。TEM检查证明肾小球上皮细胞肿胀、足突消失，内皮、系膜区及节段电子致密物沉积（图5，B）。变色酸2R－亮绿染色法所示上皮下、内皮下及系膜区少许有红色免疫复合物沉积，同时绿染基底膜均质增厚、基质增多（图5，C）。变色酸2R－亮绿法所示MPGN免疫复合物沉积的形态和部位与免疫荧光及TEM一致。

图5 MPGN C3（＋＋） A：免疫荧光IgG（＋＋）呈颗粒状沿肾小球毛细血管襻沉积；B：TEM证明肾小球上皮细胞肿胀、足突消失，内皮、系膜区及节段电子致密物沉积；C：变色酸2R－亮绿法显示上皮下、内皮下及系膜区有少许免疫复合物沉积，同时绿染基底膜均质增厚、基质增多

2.6 非免疫介导的肾小球疾病免疫荧光、TEM、光镜比较

微小病变型肾病（MCN）免疫荧光证明免疫荧光均为阴性，即肾小球系膜区和毛细血管襻均无免疫复合物沉积（图6，A）。TEM检查证明肾小球各部位均无电子致密物沉积（图6，A）。变色酸2R－亮绿染色法则均显示无免疫复合物沉积（图6，C）。在非免疫复合沉积引起的肾小球疾病的诊断中，变色酸2R－亮绿染法能够正确的“还原”肾小球病变，无假阳性情况，进而提高临床诊断的准确率。

图6 MCN A：免疫荧光均为阴性；B：TEM肾小球各部位均无电子致密物沉积；C：变色酸2R－亮绿法显示无免疫复合物沉积

3 讨论

肾组织病理检查是肾脏疾病诊断，指导治疗，判断预后及肾脏病研究中不可缺少的手段［2］。肾组织病理切片通过特殊染色可显示标本中沉积的特殊物质，如免疫复合物和淀粉样变性等，目前显示肾脏疾病中免疫复合沉积的形态和部位的主要方法是传统Masson三色染色法，但病理组织染色与阴离子染料分子的大小和组织的渗透性有关。染料的分子大小，主要依靠分子量来体现，小分子量易穿透结构致密渗透性低的组织，而大分子只能进入结构疏松渗透性高的组织［3］，而传统Masson三色染色法中的丽春红和酸性品红的分子量为480.42和585.53，而变色酸2R的分子量为468.36［4］，故变色酸2R较前两者更容易穿透结构致密的肌纤维，着色也较为鲜红；传统Masson三色染色法中苯胺蓝分子质量为737.72，而亮绿分子质量分为792.72［3］，故亮绿分子较容易与肾脏疏松的胶原纤维结合，使肾小球基膜、肾小球基底膜、系膜基质及肾间质呈绿色，并且染色对比度优于苯胺蓝。

因此将变色酸2R－亮绿染色法应用于肾脏病理的染色，变色酸2R和亮绿分别代替传统Masson三色染色法中的丽春红、酸性品红和苯胺蓝，经大量临床实践证明变色酸2R－亮绿染色法染色结果鲜艳，对比度明显，步骤简单，节省实践，总体来讲优于传统Masson三色染色法。

变色酸2R－亮绿染色法染色结果显示免疫复合物为红色、细胞核为淡红色、胶原纤维为绿色、肌纤维为红色。经过临床实践证明变色酸2R－亮绿染色法较准确反应肾小球疾病免疫复合物沉积的部位和形态，并且与TEM和免疫荧光一致，较大程度提高临床诊断率，为临床治疗提供有力依据。但经变色酸2R－亮绿染色法处理的切片，经长时间存放易褪色，如何避免变色酸2R－亮绿染色切片褪色，对此需要再做进一步研究。

［1］刘 畅，杨 琪，何志军.肾穿刺病理制片中特殊染色的问题及对策［J］.诊断病理学杂志，2014，21（5）.313.

［2］王玉芳，徐晓艳，武 彦.常用特殊染色在病理诊断中的应用［J］.实用医技杂志，2013，20（12）.1357.

［3］李继承.组织学与胚胎学实验技术［M］.北京：人民卫生出版社，2010：22－26.

［4］李健东.变色酸2R－亮绿染色法在面神经髓鞘染色中的应用［J］.中国耳鼻喉头颈外科，2004，11（4）：259.

姚伦（1962－），男，学士学位，主任医师，主要从事肾脏疾病及血液净化研究。

2015－01－12）

1007－4287（2015）10－1777－03

＊通讯作者