基于网络药理学探讨赤芍治疗新冠肺炎合并凝血功能障碍作用机制

邓启科，林俊颜，胡琳娜，郭文亮，伍晓锋，刘海敏，卢建民，陈日垦，梁子敬，洪城*

（1.广州医科大学附属第一医院急诊科 广州510120；2.广州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科 广州呼吸健康研究院 呼吸疾病国家重点实验室 广州510180；3.广州中医药大学第一附属医院心内科 广州510405）

2019 年冠状病毒（COVID-19）大流行是由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的，对身心健康以及经济发展都产生了巨大的负面影响［1］。截至目前为止COVID-19 病例数仍在不断增加。COVID-19 患者最常见的症状是发烧、疲劳、头痛、咳嗽、腹泻、喉咙痛和其他多器官系统症状［2］。重症患者会迅速发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、多器官功能障碍综合征（MODS）甚至死亡［3］。越来越多的证据表明，COVID-19 重症患者患有细胞因子风暴综合征，其涉及大量细胞因子如IL-1、IL-6 和干扰素-γ 通过正反馈循环在血液、组织和器官中循环［4，5］。细胞因子和免疫细胞之间的相互作用，最终引发ARDS 和MODS，以及死亡［6］。COVID-19 对全球健康构成的重大威胁远远超出了SARS-CoV 和MERS 的传播和风险［7］。除了显着的死亡率外，COVID-19 的另一个关键问题是受感染患者人数呈指数级增长，并且医院中的患者人数非常多［1］。虽然大多数患者仅表现出轻微症状［8］，但COVID-19 的一个特征是一部分患者在感染后短时间内出现严重并发症，例如成人呼吸综合征（ARDS）或凝血功能障碍甚至弥散性血管内凝血（DIC），随后出现败血症器官衰竭和死亡［9，10］。血栓形成（尤其是静脉血栓栓塞）已被注意到显示出COVID-19 的高发病率，并且通常与病例的严重程度有关［11］。然而，在死亡的危急病例（尸检病例）中，不仅观察到血栓，还观察到大量出血［12］。这意味着在致命的情况下，抑制纤溶型DIC 有可能变成增强型纤溶型DIC，对于COVID-19，凝血和纤溶病理可能会在短时间内迅速变化，并且需要每2-3 天进行一次随访［13］。因此亟需寻求治疗COVID-19 凝血功能障碍的思路和方法。

中医长期在传染病中发挥治疗或预防作用［14］，血栓性疾病被描述为血瘀证［15，16］，中医已经定义了一种治疗方 法，称 为“活血化瘀”［17］。在 防治COVID-19 的时，我们发现赤芍被频繁和广泛使用［18］，同时赤芍这个药物又是具有中医活血化瘀功效的治疗凝血功能障碍的常用药物［19-21］，其中赤芍总甙可以显著改善机体微循环状态，降低血清、血浆粘度，抑制ADP 诱导的血小板聚集，延长凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）［22］，但目前尚无赤芍对治疗COVID-19 患者凝血功能障碍机制的相关研究报道。网络药理学是在生物信息学、计算生物学及高通量组学等多学科融合的基础上，通过构建“网络靶标”［23］，直观的揭示中药成分、靶点、疾病之间复杂的生物学关系［24］，促进了中药研究从“单一靶标、单一药物”向“网络靶标、多成分药物”模式的转变［25］，分子对接通过受体和药物分子配体之间的相互作用来预测结合姿势和结合亲和力，这涉及分子之间的空间匹配和能量匹配［26，27］。这些方法是药理机制研究、药物研究和开发的有力工具［28］，这不仅为中医学从基于经验的医学转变为基于证据的医学提供新的途径，也为当前的药效物质、作用机制探查以及方剂配伍规律改进等药物研究提供了策略［29］。因此，本研究采用网络药理学、分子对接等方法探索当归-红花对COVID-19 合并凝血功能障碍的药理靶点和机制。

1 资料与方法

1.1 赤芍有效成分靶点预测

通过TCMSP 数据库检索赤芍化学成分信息，再根据生物利用度（OB≥30%）、类药性（DL≥0.18）、分子量（180≤MW≤500 道尔顿），筛选出符合条件的候选化合物。通过查阅文献，对不满足筛选要求，但含量高或相关活性成分多的化合物进行手动筛选。筛选完毕后，再将获得的化合物信息在小分子-蛋白靶点数据库（Swiss Target Prediction，http：∥www.swisstargetprediction.ch/）中检索，获得赤芍有效成分的靶点信息。

1.2 新冠肺炎并凝血功能障碍相关靶点预测

在GeneCards 数据库（https：∥www.genecards.org/）收集COVID-19 与Coagulation dysfunction 相关靶点信息，选取相关分数Relevance score≥5 作为分析靶点。将赤芍有效成分与新冠肺炎并凝血功能障碍相关靶点信息进行比对并取交集，即为赤芍有效成分治疗新冠肺炎并凝血功能障碍潜在作用靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建

将赤芍有效成分-新冠肺炎并凝血功能障碍相关靶点信息导入String 数据库（https：∥string-db.org/），选择Multiple Proteins 选项，Organism 选择为Homo Sapiens，再将获得的文件信息导入Cytoscape version 3.8.2 软件（Cytoscape Consortium，California，USA），绘制相互作用网络并分析，即获得靶点基因对应的蛋白质互作（PPI）关系图。

1.4 靶点GO 及KEGG 通路富集分析

用DAVID 数据库及Cytoscape 软件的ClueGO APP 对赤芍有效成分与新冠肺炎并凝血功能障碍的共作靶点进行KEGG 通路分析及GO 富集分析（包括分子功能（Molecular Function）、生物过程（Biological Process）、和细胞组成（Cellular Component）。

2 结果与分析

2.1 赤芍有效成分-新冠肺炎并凝血功能障碍相关靶点筛选

赤芍有效成分化学见表1。Swiss Target Prediction数据库共获得238 个赤芍有效成分相关靶点信息，GeneCards 数据库检索共获得744 个新冠肺炎并凝血功能障碍相关靶点，将赤芍有效成分靶点信息与新冠肺炎并凝血功能障碍靶点信息进行比对，并取交集（图1），共获得50 个赤芍有效成分与新冠肺炎并凝血功能障碍相关靶点，见图2。

图1 赤芍有效成分-新冠肺炎并凝血功能障碍相关靶点

图2 赤芍与新冠肺炎并凝血功能障碍靶点PPl 网络

表1 赤芍有效成分

2.2 赤芍有效成分-靶点-新冠肺炎并凝血功能障碍蛋白互作（PPI）网络模型分析

应用Cytoscape 3.8.2 软件对赤芍有效成分-新冠肺炎并凝血功能障碍相关靶点信息建立PPI 网络。在Cytoscape 中使用CytoHubba 插件计算节点间相互作用Degree（2-78）获取Degree 值前5 个基因 为 枢 纽 基 因（AKT1、TNF、VEGFA、EGFR、MAPK3），预示这些靶点可能是赤芍治疗新冠肺炎并凝血功能障碍的关键靶点。

2.3 赤芍有效成分-新冠肺炎并凝血功能障碍相关靶点GO 富集分析

用Cytoscape 软件的ClueGO APP 对赤芍有效成分与新冠肺炎并凝血功能障碍的共作靶点进行GO 富集分析（图3），包括分子功能（Molecular Function）、生物过程（Biological Process）、和细胞组成（Cellular Component）。GO 富集分析描述了赤芍有效成分抗新冠肺炎并凝血功能障碍的预测靶点参与GO 功能富集后富集数目较多的有外部凋亡信号通路调控，上皮细胞增殖正调控，白细胞分化正调控，平滑肌细胞增殖调控，不饱和脂肪酸代谢过程。

图3 GO Term 图

2.4 赤芍有效成分-新冠肺炎并凝血功能障碍相关靶点KEGG 通路富集分析

通过DAVID 数据库进行KEGG 通路富集分析，得到79 条通路。绘制显著性前20 的通路的条形图和点线图（见图4），KEGG 富集通路分析显示赤芍治疗COVID-19 伴凝血功能障碍主要通路有蛋白聚糖在癌症中的作用、癌症的途径、非小细胞肺癌、ErbB 信号通路、HIF-1 信号通路、甲型流感、mTOR信号通路、癌症中枢碳代谢、神经胶质瘤、MAPK 信号通路等。

图4 赤芍治疗新冠肺炎并凝血功能障碍的KEGG 富集分析图

3 讨论

SARS-CoV-2 是一种有包膜的正链单链RNA 病毒，它编码四种结构蛋白：尖峰、包膜、膜和核衣壳［30］。刺突蛋白（S 蛋白）通过自发的构象变化促进宿主感染和病毒-细胞膜融合［30］。SARS-CoV-2使用血管紧张素转化酶II（ACE2）进入细胞，这也是SARS-CoV 入口的受体［31，32］，ACE2 与S 蛋白的结合是SARS-CoV-2 进入宿主细胞的必要前提，因此ACE2 被认为是SARS-CoV-2 感染的“门把手”［33］。中医认为赤芍苦平无毒，具有活血散瘀，疏通血脉之功，为气血并治复方中的主要药物，合用有活血理气，化瘀止痛之功效，临床观察赤芍对冠心病心绞痛具有较好的疗效，赤芍提取物可显著改善大鼠的血液流变性，在中医临床治疗血瘀性疾病中发挥独特的作用［34，35］。

通过TCMSP 数据库检索赤芍化学成分信息，再根据生物利用度（OB≥30%）、类药性（DL≥0.18）、分子量（180≤MW≤500 道尔顿），筛选出符合条件的候选化合物再结合文献筛选出14 个赤芍的有效成分。通过靶点预测得到赤芍作用于新冠肺炎伴凝血功能障碍的靶点共50 个，经PPI 网络筛选后的核心靶标共5 个，主要为TNF、AKT1、VEGFA、EGFR、MAPK3 等，PPI 网络拓扑学特征以炎症反应、细胞周期调节以细胞凋亡相关的蛋白居多，与GO 富集分析结果相互印证。采用赤芍中筛选出的14 种有效成分及50 个交集靶点，生物学功能构建活性成分-蛋白靶点-生物学功能网络，发现赤芍具有多成分、多靶点、多种生物学功能的作用特点。其中TNF的度值远高于其他核心靶点，推测TNF 是赤芍治疗COVID-19 伴凝血功能障碍的关键靶点，研究发现新型冠状病毒肺炎危、重型患者炎症因子如TNF-α 水平急剧升高，减轻炎症反应可以减轻对机体的损伤［36］，于玉芳等发现血清IL-6、TNF-α、CRP 与凝血功能紊乱有关［37］。研究显示异常T 细胞分化和淋巴细胞减少是严重COVID-19 疾病的标志。由于T细胞必须竞相淘汰受感染的细胞，因此它们可以快速分化并实现细胞毒性功能，而Akt-Fas 可以抑制COVID-19 中异常的T 细胞分化和凋亡［38］，PI3KAKT 信号通路还参与调节急性出血性脑卒中［39］；COVID-19 住院患者的血管生成标志物VEGFA 升高，并且可以预测感染患者的预后［36］，且VEGFA 参与调节凝血及纤溶系统、改善血管功能从而抗冠状动脉粥样硬化［40］。国外研究提供了关于SARSCoV-2 对EGFR/ERK 信号的依赖的新见解，并证明了 EGFR/ErbB 抑制剂对COVID-19 治疗的效用［41］，活化的凝血因子Ⅶ（FVIIa）作为组织因子（TF）目前唯一明确的配体蛋白，TF/FVIIa 通路和EGFR 通路之间存在相互调节作用［42］。国内研究发现MAPK1、MAPK3 是COVID-19 发病的主要靶点［43］，还有研究发现MAPK3 蛋白参与肺损伤的炎症反应，抑制MAPK3/MAPK1 可以降低肺损伤中促炎细胞因子如TNF-α 和IL-1β 的水平［44］，而研究显示PLC-PKC-MAPKs 通路可以调控凝血酶诱导的血小板活化和聚集［45］。

GO 富集分析显示GO 功能富集后富集数目较多的有外部凋亡信号通路调控，上皮细胞增殖正调控，白细胞分化正调控，平滑肌细胞增殖调控，不饱和脂肪酸代谢过程。KEGG 富集通路分析显示赤芍治疗COVID-19 伴凝血功能障碍主要通路有蛋白聚糖在癌症中的作用、癌症的途径、非小细胞肺癌、ErbB 信号通路、HIF-1 信号通路、甲型流感、mTOR信号通路、癌症中枢碳代谢、神经胶质瘤、MAPK 信号通路等，这与PPI 网络筛选出的核心靶标TNF、AKT1、VEGFA、EGFR、MAPK3 等基本符合。故赤芍-交集靶标-COVID-19 伴凝血功能障碍网络图关联复杂，可见赤芍治疗COVID-19 伴凝血功能障碍是通过多靶点、多途径之间的相互作用实现的，并且蕴含着多种潜在的治疗作用。

4 结论

本文通过网络药理学认为赤芍治疗COVID-19伴凝血功能障碍的作用机制与癌症的途径、ErbB 信号通路、HIF-1 信号通路、甲型流感、mTOR 信号通路、MAPK 信号通路等可能有关，作用于TNF、AKT1、VEGFA、EGFR 和MAPK3 等相关受体。目前关于其中的机制研究较少，尽管以上结论是通过查阅数据库所得，仍可为科研实验提供了新思路。本次获得信号通路可能就是赤芍治疗COVID-19 伴凝血功能障碍的主要通路，后续可通过动物、细胞实验对通路及相关因子进行验证，以期为中医药的发展提供更好的基础理论依据，为中医药的蓬勃发展做贡献。