长链非编码RNA LncRNA ADAMTS9-AS2 在肝母细胞瘤中的表达及生物学作用

梁敏，蔡慧慧，周佩燕，谭智琼*

（1.广州医科大学附属第五医院肿瘤科，广东 广州510700；2.广东省人民医院儿童血液科，广东 广州510000；3.广州市白云区第三人民医院，广东 广州510000）

肝母细胞瘤（hepatoblastoma，HB）是儿童最常见的肝脏恶性肿瘤，占所有儿童肝脏恶性肿瘤的2/3，年发病率为0.5%～1.5%［1］。肝母细胞瘤是0-5岁儿童最常见的儿童肝脏恶性肿瘤之一，其发病年龄多为出生后6 个月至3 年，在小儿腹部实体肿瘤中的发病率排第三位［2］。肝母细胞瘤的病因和发病机制目前尚未完全阐明。目前，Beckwith-Wiedemann 综合征、家族性腺瘤性息肉病和18 三体综合征是其公认的先天性危险因素。此外患儿母亲若患羊水过多、子痫、孕期早期肥胖、吸烟史、以及新生儿出生体重＜1500 g 等因素，亦会进一步增加HB 的发病概率［2-4］。目前HB 的治疗主要仍是以铂类为主的化疗联合根治性手术治疗为主。但是，肝脏病灶往往无法完全切除，手术后的复发转移常常导致患者预后不佳，同时铂类药物会引起患儿听力损害等副作用，亦是限制其治疗的因素［5］。目前公认的分子生物学标志物仍未被发现，因此深入开展HB 的分子遗传学研究将有助于制定更加精准的危险度分层体系，进而为HB 患者的治疗提供有效靶点。因此，完善发病的分子机制和寻找有效的治疗靶点是目前HB 治疗最为迫切的需要。

lncRNA 是一类非编码蛋白、转录本长度超过200nt 的非编码RNA 分子，其编码基因广泛分布于基因组内［6］。与miRNAs 和其他较小的非编码RNA不同，lncRNAs 可以通过多种途径在转录和转录后水平上通过顺式和反式调节作用来调节下游靶基因。LncRNA ADAMTS9-AS2 是一种位于人染色体3p14.1，由2 258 个核苷酸组成，是含凝血酶敏感素基序的去整合素金属蛋白酶9（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif 9，ADAMTS9）基因的反义RNA，其已被报道在胶质瘤［7］、肺癌［8］.、卵巢癌［9］、胃癌［10］和唾液腺癌［11］.中发挥重要的生物学作用。然而，对于 LncRNA ADAMTS9-AS2 在肝母细胞瘤中的表达及生物学效应目前尚不清楚。基于此，本研究通过探索LncRNA ADAMTS9-AS2 在肝母细胞瘤中的表达特性及其与临床病理特征的联系，研究LncRNA ADAMTS9-AS2 在肝母细胞瘤中的分子机制，为探寻出新的分子生物学标志物和有效的治疗靶点提供理论基础，对改善肝母细胞瘤的患儿的临床预后具有重要临床意义。

1 材料与方法

1.1 组织样本信息

本研究共收集45 对肝母细胞瘤组织和配对的正常组织标本，并且对其临床病理特征进行评价。所有参与本研究的组织标本均购于广州铖铵生物科技有限公司。

1.2 细胞培养

本研究所采用的正常人肝细胞（L02）、肝母细胞瘤细胞（HepG2 和Huh6）均从中国上海公司ATCC 获得。将细胞系培养在含10%胎牛血清的McCoy’ s5a 培养基中（Gibco，Grand Island，NY，USA）以37°C、5%CO2 的环境培养。每24 h 更换一次培养基，细胞密度超过70%时，以0.25%胰酶消化进行传代培养

1.3 细胞转染

采用ADAMTS9-AS2 质粒载体（pc-ADAMTS9-AS2）以上调LncRNA ADAMTS9-AS2 的表达。取指数生长期的HepG2 细胞按1.2 方法进行培养。待HepG2 细胞密度为70%～80%时，使用lipofectamine 3000 转染试剂将pc-ADAMTS9-AS2 质粒或空载质粒（pc-NC）以2 000 ng/孔转染到HepG2 细胞中。转染48 h 后，采用RT-qPCR 检测不同转染组中LncRNA ADAMTS9-AS2 的表达水平。

1.4 实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测

首先，从冰冻组织和细胞系中提取总RNA（TRIzol；Invitgen，USA），然后用PrimeScript RT Master Mix（T Akara）将其转录为cDNA。随后，使用试剂盒（SYBR PreMix Ex T AQ II Kit；T Akara）分析LncRNA ADAMTS9-AS2 的表达。最后，采用2-ΔΔCT方法对蛋白质的折叠变化进行评价，并以磷酸甘油醛脱氢酶作为内源性参照。引物序列如下：ADAMTS9 AS2：forward 5′-TTTACCATGCGCTGAGTGAG-3′，reverse 5′AAAGTTGCGTCATGCTTCGG-3′；GAPDH：forward 5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，reverse 5′-GAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。

1.5 CCK-8 测定

首先，将LncRNA ADAMTS9-AS2 过表达的肝母细胞瘤细胞株从培养瓶中收集并接种于96 孔板中（5×103个细胞/孔）。经培养24、48、72、96 h 后，每孔加入含10% CCK-8 溶液100 μL。最后，使用微型平板读取器（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）读取每孔的A值。

1.6 Transwell 迁移和侵袭实验

为了解LncRNA ADAMTS9-AS2 对肝母细胞瘤的细胞迁移影响，我们将细胞消化并适度稀释，平板计数仪检测细胞密度。Transwell 小室上层预先用Matrigel 基质胶包被，再将含5×104个转染细胞的细胞悬液加入200 μL 无血清培养基接种于小室上层；小室下层加入600 μL 含20%血清的培养基。24 小时后用4%多聚甲醛固定细胞，2.5%结晶紫染色20 min，在光学显微镜下随机选取5 个视野拍照并计数，重复3 次。

1.7 上皮细胞-间充质转化（EMT）分析及其相关蛋白印迹分析

为了解LncRNA ADAMTS9-AS2 对肝母细胞瘤的上皮细胞-间充质转化影响，将收集的细胞加入适量RIPA 裂解液提取新鲜冰冻组织或者细胞的总蛋白，用BCA 法测定蛋白浓度，每个孔的上样量调整为15 μg，经SDS-PAGE（10%）凝胶电泳后，凝胶蛋白转移到硝酸纤维素膜。经过5%BSA 封闭后，以E-Ca，N-Ca，Vimentin，Slug 一抗（1 ∶1 000），GAPDH抗（1 ∶1 000）置4 ℃冰箱孵育过夜。次日，经PBST洗涤3 次后，以二抗（1 ∶1000）常温孵育2 h。经PBST 洗涤3 次，ECL 化学发光法显像并保存图像。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 临床表达与临床参数相关性

通过对癌旁正常组织与肝母细胞瘤中LncRNA ADAMTS9-AS2 的表达量分析，我们可以知道，相对于癌旁正常组织，肝母细胞瘤病灶中LncRNA ADAMTS9-AS2 的表达水平较其配对癌旁正常组织明显下调。见图1。临床病理特征相关性分析显示肝母细胞瘤患者组织中ADAMTS9-AS2 的表达高低与患者的年龄、性别（P＞0.05）无关，而与肿瘤大小、组织类型、淋巴结转移情况有关。（P＜0.05，表1）。并且，LncRNA ADAMTS9-AS2 高表达状态往往预示着患儿肿瘤病灶小、组织分化程度好和淋巴结阴性等临床病理特点。

图1 LncRNA ADAMTS9-AS2 在人肝母细胞瘤组织和癌旁正常组织中的表达水平比较

表1 LncRNA ADAMTS9-AS2 表达量和肝母细胞瘤患儿临床病理特征的关系

2.2 肝母细胞瘤细胞内LncRNA ADAMTS9-AS2 的表达水平及LncRNA ADAMTS9-AS2 低表达的细胞模型构建

为证实LncRNA ADAMTS9-AS2 是否与肝母细胞瘤发生发展相关，我们检测肝母细胞瘤细胞与人正常肝细胞中LncRNA ADAMTS9-AS2 的表达水平，RT-qPCR 结果显示：相对于人正常肝细胞（L02），LncRNA ADAMTS9-AS2 在Huh6 细胞和HepG2 细胞中的表达水平均明显下调，其中HepG2 细胞在所有肝母细胞瘤细胞中呈现相对低表达状态（图2A）。基于此，接下来我们利用HepG2 细胞株进行实验。本研究利用质粒转染技术构建LncRNA ADAMTS9-AS2 过表达的HepG2 细胞株，结果提示：相对于阴性对照组（pc-NC），质粒转染组可显著增强HepG2 细胞内LncRNA ADAMTS9-AS2 的表达水平（图2B），这提示LncRNA ADAMTS9-AS2 过表达的HepG2 细胞模型被成功构建。

2.3 过表达LncRNA ADAMTS9-AS2 显著抑制肝母细胞瘤细胞的增殖能力

在HepG2 细胞内LncRNA ADAMTS9-AS2 明显过表达后（图2A），CCK-8 检测结果显示：在HepG2细胞中，实验组（OE-LncRNA ADAMTS9-AS2）的细胞增殖能力明显低于对照组（OE-vector）（P＜0.001，图3）。这说明上调细胞内LncRNA ADAMTS9-AS2的表达能显著抑制肝母细胞瘤细胞的增殖能力。

图2 肝母细胞瘤细胞内LncRNA ADAMTS9-AS2 的表达水平及LncRNA ADAMTS9-AS2 低表达的细胞模型构建

图3 上调ADAMTS9-AS2 的表达后能显著抑制HepG2 细胞株的体外增殖能力

2.4 过表达LncRNA ADAMTS9-AS2 后能显著抑制肝母细胞瘤细胞的侵袭及转移能力

为了进一步探究LncRNA ADAMTS9-AS2 对肝母细胞瘤细胞侵袭转移能力的影响，在本研究中我们还进行了Transwell 实验，其结果显示：在HepG2 细胞中，pc-ADAMTS9-AS2 组的细胞迁移能力（P＜0.001；图4）和侵袭能力（P＜0.001；图4）均较pc-NC 组明显下降。这说明过表达LncRNA ADAMTS9-AS2 后能显著抑制肝母细胞瘤细胞的侵袭及转移能力。

图4 增强ADAMTS9-AS2 的表达后，HepG2 细胞的侵袭能力和转移能力检测

2.5 过表达ADAMTS9-AS2 抑制上皮-间充质转化（EMT）

为了进一步探究ADAMTS9-AS2 对肝母细胞瘤细胞侵袭转移能力的影响，对对照组（pc-NC）和实验组（pc-ADAMTS9-AS2）进行上皮-间充质转化（EMT）相关蛋白的蛋白印迹分析，实验结果表明，pc-ADAMTS9-AS2 组中，代表上皮细胞-间充质转化的E-Ca 蛋白表达显著升高，蛋白N-Ca 和Vimentin表达显著降低。在肿瘤EMT 的过程中，E-Ca 蛋白的减少和N-Ca 的增加起重要的推动作用。因此，此结果说明ADAMTS9-AS2 的过表达能够显著抑制肝母细胞瘤细胞的上皮-间充质转化（EMT），抑制肿瘤转移。见图5。

图5 过表达ADAMTS9-AS2 抑制上皮-间充质转化

3 讨论

HB 在全球发生率为5/10 万～15/10 万［12］。近年来HB 的发病率以每年4%的速度增长，大于其他儿童肿瘤的发病率增长速度［13］。由于HB 手术和化疗方案的改良，患儿预后较以往得到很大改善，但是，相对于其他儿童实体肿瘤的治愈率仍较低。目前HB 的病因仍不清楚，有研究指出，HB 在家族性腺瘤息肉病患者中较多见。并有研究指出MPO、SULT、等基因也与HB 的发生发展密切相关［14］。HB 可能还与子痫前期、羊水异常、父母生育功能障碍等有关。患儿双亲吸烟对HB 的形成也有促进作用［15］.但总的来说，目前HB 的根本病因仍不清楚。因此，阐明HB 的内在分子机制可能为肝母细胞瘤患儿的治疗带来新的启发。随着分子生物学的进步，寻找肝母细胞瘤的关键调控靶标成为了可能，完善发病的分子机制和寻找有效的治疗靶点可为临床治疗HB 提供关键性的指导作用。

据今年研究报道，ADAMTS9 基因在鼻咽癌、乳腺癌、胃癌和结肠癌等多种癌症中均以抑癌基因的功能被报道，其在抑制细胞增殖、抑制肿瘤转移和血管生成方面具有显著的作用［16-19］。相关研究指出：于肺癌、胃癌、卵巢癌中也可观察到ADAMTS9-AS2的异常低表达。以上研究表明，ADAMTS9-AS2 可能作为抑癌因子调控相关的细胞信号通路以调控癌细胞的增殖、凋亡和转移等生物学行为［20-22］。因此，ADAMTS9-AS2 的低表达可预示着患者的预后不良。然而，肝母细胞瘤中的ADAMTS9-AS2 表达情况及其对肝母细胞瘤的生物学行为影响仍未被研究。因此，研究肝母细胞瘤中ADAMTS9-AS2 的表达方式和生物学功能具有重要意义。

基于以上背景，为明确ADAMTS9-AS2 在肝母细胞瘤中的生物学调控作用，本研究还通过realtime PCR 法在40 例配对的儿童肝母细胞瘤组织及外周正常组织标本中对ADAMTS9-AS2 的表达水平进行分析，结果发现肝母细胞瘤组织中ADAMTS9-AS2 的表达水平明显低于癌旁正常组织。且临床病理相关性分析表明，ADAMTS9-AS2 的低表达状态往往预示着患儿肿瘤分化程度低、肿瘤分期晚以及淋巴结侵犯等肿瘤恶性表型。因此可推测，对于肝母细胞瘤患儿，ADAMTS9-AS2 的表达水平越低与患儿的预后差、死亡率高相关，ADAMTS9-AS2 有可能在肝母细胞瘤中起抑癌作用。同时，我们的实验结果和以往在肺癌、胃癌、卵巢癌的研究中相一致。

为探究ADAMTS9-AS2 对肝母细胞瘤的生物学行为的影响，我们通过质粒转染技术成功构建ADAMTS9-AS2 过表达的肝母细胞瘤细胞模型。研究结果提示，ADAMTS9-AS2 的过表达能显著抑制肝母细胞瘤细胞的增殖能力。同时，在以往的研究中，ADAMTS9-AS2 在肺癌、胃癌、卵巢癌细胞中构建过表达细胞株，亦能显著抑制其增值能力。L i 等人研究发现在结肠癌组织中的ADAMTS9-AS2 存在异常低表达，通过构建起过表达细胞系能够显著抑制起细胞的增殖能力［23］。本研究同时通过Transwell 实验指出，ADAMTS9-AS2 对癌细胞迁移与侵袭转移能力亦被抑制。同时，蛋白印迹实验也指出，ADAMTS9-AS2 亦能抑制上皮-间充质转化相关蛋白的表达，说明ADAMTS9-AS2 能够抑制癌细胞的上皮-间充质转化从而抑制癌细胞的转移。

综上所述，lncRNA ADAMTS9-AS2 通过抑制肝母细胞瘤细胞的增殖和转移发挥抑癌基因的作用，为深入研究肝母细胞瘤发病及进展机制提供了理论依据。同时，ADAMTS9-AS2 作为早期肝母细胞瘤患者的预后因子，有望用于指导临床治疗和术后随访。其临床应用和作用分子机制有待进一步研究。