抗癌解毒开窍方通过PI3K/Akt 信号通路抑制U87胶质瘤细胞增殖与迁移的研究

王维强，陈广鸿，叶晓莹，黄华聪，杜秀婷，黄玉筠，高卓维，，，4*

（1.广州中医药大学顺德医院，广东 佛山528300；2.南方医科大学中医药学院分子生物学实验室 国家中医药管理局三级科研实验室，广东 广州510515；3.南方医科大学顺德医院，广东 佛山528308；4.南方医科大学第三附属医院，广东 广州510630）

胶质母细胞瘤是在大脑最常见的原发性恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的40%［1］。尽管包括手术、放疗和化疗在内的治疗策略取得了重大进展，但胶质母细胞瘤患者的5 年整体存活率仍然很低［2］。胶质母细胞瘤局部异常增殖和侵袭是患者死亡的主要原因，目前临床上只有替莫唑胺和卡莫司汀两种药物用于治疗胶质母细胞瘤，然而这两种药物均伴有极大的副作用以及容易产生耐药性，因此寻找新的治疗药物是亟需解决的［3］。本研究拟通过U87 胶质瘤细胞模型，并给予抗癌解毒开窍方含药血清进行干预，观察抗癌解毒开窍方治疗胶质瘤作用并进一步探讨抗癌解毒开窍方抑制胶质瘤的作用机理。

1 材料和方法

1.1 动物和细胞

SD 大鼠购自广州中医药大学动物实验中心，实验单位使用许可证号SYXK（粤）20200056，动物实验通过广州中医药大学实验动物伦理委员会伦理审查（20210731001），U87 细胞购买自中科院上海细胞库。

1.2 试剂

DMEM 高糖培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶购买自美国Gibco 公司。CCK-8 购买自北京同仁。结晶紫染色液购买自凯基生物科技有限公司。PI3K（ab32089）、p-PI3K（ab278545）、Akt（ab18785）、p-Akt（ab81283）、GAPDH（ab8245）抗体购自美国Abcam 生物科技有限公司。

1.3 中药配制及含药血清制备

中药购买自致信药业，抗癌解毒开窍方由常规人的用量为：藤梨根90 g、山慈菇15 g、半枝莲15 g、龙葵15 g、肿节风20 g、壁虎10 g、土鳖虫5 g、桃仁10 g、石菖蒲5 g。抗癌解毒开窍方低、中、高浓度组分别为0.5、1、2 倍常规人用量，常规煎煮中药备用。取健康SD 雄性大鼠80 只，SPF 级，体重（220±10）g，适应性饲养7 d，随机分为4 组（对照组20 只、抗癌解毒开窍方低、中、高浓度组各20 只），按人与大鼠体表面积比换算给药等效剂量［4］，对照组和抗癌解毒开窍方分别给予生理盐水或煎煮好的抗癌解毒开窍方（9.8 g/kg、19.6 g/kg、39.2 g/kg），以1.5 mL/100 g 的比例灌胃，每12 h 一次，每日2 次，共7 d，第8 天于大鼠灌胃后2 h 内，无菌条件下行腹主动脉采血，离心取血清，56 ℃下30 min 灭活补体，经无菌细胞过滤器除去细菌后-20 ℃保存备用。

1.4 CCK-8 检测细胞活力

收集对数生长期的U87 细胞（5×103个/孔）接种于96 孔板，培养24 h 后，分别加入5%抗癌解毒开窍方低、中、高浓度组含药血清以及对照血清处理24 h。每个孔加入10 μL CCK-8 溶液，并在37 ℃细胞培养箱中继续孵育1.5 h。使用微孔板读取器测量450 nm 波长的A值计算各组细胞活力。

1.5 EdU 染色检测细胞增殖能力

消化、离心收集U87 细胞、调整细胞密度至5×103个接种于96 孔板中，待细胞贴壁长至约80%后，加入5%抗癌解毒开窍方低、中、高浓度组含药血清以及对照血清，并在培养基中加入10 μm EdU溶液处理24 h后，4%多聚甲醛固定细胞，然后根据试剂盒说明书依次进行Apollo567 和Hochest33342染色。荧光显微镜下分别对3 个随机视野下的蓝色细胞（Hochest33342，总细胞）及红色细胞（EdU，EdU阳性细胞）计数，EdU 阳性百分比=EdU 阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.6 Transwell 细胞迁移实验

使用Transwell 细胞迁移实验评估细胞迁移能力。实验前，U87 细胞在37 ℃培养箱中饥饿24 h。随后消化收集细胞，并重悬于的无血清DMEM 培养基中。调整细胞浓度至1×105并接种于上室，加入抗癌解毒开窍方含药血清，同时24 孔板下室加入500 μL 含有10% FBS 的DMEM 培养基。在37 ℃培养箱继续孵育24 h 后，迁移细胞在室温下用4%的多聚甲醛固定10 min，接着用结晶紫染色20 min。用光学显微镜在5 个随机选择的视野中计算染色细胞。

1.7 蛋白印迹分析（Western blot）

U87 细胞用不同浓度抗癌解毒开窍方含药血清处理24 h。使用RIPA 缓冲液从细胞中提取总蛋白质。使用BCA 蛋白定量试剂盒对总蛋白质进行定量。取20 μg 细胞总蛋白质通过10%SDS-PAGE 分离，并转移到PVDF 膜。随后，在室温下，使用5%的脱脂牛奶将膜封闭1 h。然后膜与相应的一抗进行孵育，主要包括以下抗体：PI3K（1 ∶1 000）、p-PI3K（1 ∶1 000）、AKT（1 ∶1 000）、p-AKT（1 ∶1 000）以及GAPDH（1 ∶3 000）。经过一夜的孵育后，膜与二抗在室温下继续孵育1 h。蛋白条带通过ECL 化学发光发进行可视化。蛋白表达是使用image J 软件与GAPDH 作为内源性参照进行量化。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 抗癌解毒开窍方对U87 细胞活力和增殖的影响

为了研究抗癌解毒开窍方的潜在抗肿瘤作用，采用CCK-8 评估了不同浓度的抗癌解毒开窍方含药血清处理24 h 对U87 细胞活力的影响。结果表明，在干预24 h 后，抗癌解毒开窍方含药血清显著抑制了U87 细胞的活性，并呈浓度依赖性。接着我们采用EdU 染色法检测不同浓度抗癌解毒开窍方对U87 细胞增殖能力的影响，结果如图1B-C 所示，与对照组相比，抗癌解毒开窍方低、中、高浓度组均能抑制U87 细胞的增殖能力（P＜0.05）。EdU 染色结果与CCK-8 结果一致，提示抗癌解毒开窍方含药血清能够抑制U87 细胞的活力与增殖。

图1 抗癌解毒开窍方抑制U87 胶质瘤细胞活力与增殖

2.2 抗癌解毒开窍方对U87 细胞迁移的影响

我们采用Transwell 细胞迁移实验观察抗癌解毒开窍方含药血清对U87 细胞迁移的影响。分别用不同浓度抗癌解毒开窍方处理细胞16 h 后对迁移细胞进行染色。结果如图2 所示，与对照组细胞（553.9±42.7 个/视野）相比，在抗癌解毒开窍方含药血清治疗后，U87 细胞的迁移能力显著下降（P＜0.05），抗癌解毒开窍方低、中、高浓度组每视野的迁移细胞数分别为458.5±39.0、328.0±35.5、168.1±21.4 个。Transwell 细胞迁移实验结果表明，抗癌解毒开窍方含药血清抑制了U87 细胞的迁移能力。

图2 抗癌解毒开窍方抑制U87 细胞迁移

2.3 抗癌解毒开窍方对U87 细胞PI3K/Akt 信号通路的影响

PI3K/Akt 信号通路在肿瘤细胞增殖的调控中起着关键作用。为了研究抗癌解毒开窍方含药血清对胶质母细胞瘤PI3K/Akt 信号通路的影响，我们采用western blot 检测抗癌解毒开窍方含药血清处理后U87 细胞蛋白表达水平。结果如图3 所示，经过抗癌解毒开窍方含药血清处理后，与对照组细胞相比，U87 细胞中的p-PI3K 和p-Akt 的表达显著减少（P＜0.05）。结果表明，抗癌解毒开窍方含药血清处理降低了U87 细胞中PI3K/Akt 信号通路的蛋白表达。

图3 抗癌解毒开窍方抑制U87 细胞PI3K/Akt 信号通路激活

3 讨论

胶质母细胞瘤是最具有攻击性的原发性脑肿瘤，中位存活率约为14.6 个月［5］。侵入性是胶质母细胞瘤的主要特征，在发现时恶性细胞多已扩散到正常的脑组织，导致极少患者能够行使神经外科手术作做为根治性治疗。肿瘤异质性是传统化疗和靶向治疗失败的另一个重要因素［6］。胶质母细胞瘤患者预后不佳，且大多患者会出现复发性肿瘤并产生抗药性。因此需要新的治疗方法来针对胶质母细胞瘤的潜在抵抗机制。

中医学并无“胶质瘤”之病名，根据其病灶部位，可将其归为“头风”、“头痛”、“癫痫”、“偏枯”等。祖国传统医学对胶质瘤的认识，仅限于该疾病引起的各种症状，如头痛、眩晕、呕吐等，因此现代各大医家对该疾病的病因病机的论述各有见解。通过综合分析针对胶质瘤的11 篇临床报道［7-8］，我们认为癌毒结聚是其主要病机。我们前期研究也指出：正气亏虚基础上，痰凝、血瘀参与肿瘤微环境的重构，是导致癌毒结聚的关键因素［9］。而对于脑胶质瘤而言，临床上更多时候表现为邪去则正安。我们根据上述理论和临床实践，总结出抗癌解毒开窍方。抗癌解毒开窍方由藤梨根、山慈菇、半枝莲、龙葵、肿节风、壁虎、土鳖虫、桃仁、石菖蒲组成。该复方的合理组合，分别从抗癌和开窍两个方面治疗脑胶质瘤，较好契合胶质瘤以“癌毒结聚”为主的病因病机，同时能够“引药入脑”。研究发现抗癌解毒开窍方的君药藤梨根具有良好的抗肿瘤作用［10］，我们的既往研究发现藤梨根中的两个主要活性成分熊果酸和齐墩果酸通过促肿瘤细胞凋亡、铁死亡以及抑制上皮间质转化发挥抗肿瘤作用［11］。半枝莲与山慈菇、龙葵与肿节风、桃仁与土鳖虫是林丽珠教授治疗恶性肿瘤的经验常用药对［12］。现代药理研究表明半枝莲通过下调端粒酶活性抑制U251 胶质瘤细胞增殖、促进细胞凋亡［13］。开窍药石菖蒲现代药理研究表明能降低缺血再灌注小鼠脑梗塞的大小，改善了脑水肿，降低了血脑屏障渗透性，恢复了神经功能［14］。本研究对抗癌解毒开窍方抑制胶质瘤作用进行研究。CCK-8 结果显示抗癌解毒开窍方剂量依赖性地抑制U87 胶质瘤细胞活性。进一步EdU 染色结果提示抗癌解毒开窍方能够显著抑制胶质瘤细胞的体外增殖。Transwell 迁移实验结果则提示，抗癌解毒开窍方显著抑制胶质瘤细胞的迁移。以上结果提示抗癌解毒开窍方能够有效地抑制胶质瘤细胞增殖和迁移。

据报道，PI3K/Akt 信号通路是大多数人类癌症中最常激活的途径之一［15］。Akt 被认为是PI3K/Akt 信号通路的中心蛋白，调节100 多个下游基质的活动。Akt 是一种血清/三氨酸蛋白激酶，磷酸激活后在细胞恶性转化中起着至关重要的作用。Akt活化被认为是许多人类癌症的标志，它通过促进细胞增殖与迁移，抑制细胞凋亡，并增加肿瘤突变率促进癌症的发展［16］。研究发现替莫唑胺通过激活PI3K/Akt 信号通路从而活化胶质瘤细胞中Wnt/βcatenin 信号通路，这可能导致替莫唑胺疗效下降以及耐药性的出现［17］。抑制Akt 能够抑制胶质瘤细胞增殖与迁移，促进胶质瘤细胞凋亡［18］。因此，针对Akt 信号通路是寻找肿瘤治疗新药物的一个重要方向。本研究发现，抗癌解毒开窍方能显著抑制U87 胶质瘤细胞中p-PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平，提示抗癌解毒开窍方抑制U87 胶质瘤细胞增殖与迁移的作用可能是通过抑制PI3K/Akt 信号通路发挥的。研究发现抗癌解毒开窍方中多种有效成分具有抑制PI3K/Akt 信号通路的作用。半枝莲总黄酮抑制PI3K/Akt/mTOR 通路，诱导肿瘤细胞自噬及凋亡，抑制裸鼠皮下一移植瘤的生长［19］。甘草查尔酮A 抑制肾癌细胞增殖、迁移、侵袭，并诱导肾癌细胞发生自噬，这些作用可能与其抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路有关［20］。这些有效成分可能是抗癌解毒开窍方抑制PI3K/Akt 信号通路发挥抗胶质瘤作用的物质基础。中药复方治疗肿瘤往往是通过多通路多靶点发挥作用，我们在后续的研究将更深入研究抗癌解毒开窍方的潜在作用机制。

综上所述，本研究表明抗癌解毒开窍方能抑制胶质瘤细胞增殖与迁移，其作用机制可能是通过抑制PI3K/Akt 信号通路发挥的。