应用细胞和分子遗传学技术检测一例嵌合型21q 部分三体

黄霜，陈芳，陈素琴

（1.广州市番禺区何贤纪念医院检验科，广东 广州511400；2.中山大学中山医学院遗传学与细胞生物学教研室，广东 广州510080）

随着分子诊断技术的发展，越来越多的技术可以应用于产前筛查及产前诊断，不同技术有各自的特点，各有优势，可以相互取长补短，但并无法完全相互替代［1-2］。本文报道一例产前诊断中联合应用多种检测方法检测出的嵌合型21q 部分三体病例。

1 对象与方法

1.1 患者临床资料

胎儿父母年龄分别为32 岁和31 岁，本次妊娠为第二次怀孕，自然怀孕，12 周NT：0.9mm，早期唐氏筛查21 三体风险1：381，临界风险，于14+w 进行孕妇外周血胎儿游离DNA 无创产前检测（NIPT），结果提示：21 三体高风险，Z=11.92；于18+w，选择羊膜腔穿刺，行染色体核型分析、多重荧光定量聚合酶链反应（QF-PCR）和单核苷酸多态性微阵列芯片（SNP-array）检测以明确额外小标记染色体（small supernumerary marker chromosome，sSMC）的来源和组成，停经23+5周B 超显示宫内胎儿发育符合孕周，未发现结构异常。经遗传咨询，家属选择终止妊娠，拒绝病理解剖。终止妊娠后夫妻双方进行外周血染色体检查。首次妊娠7w 因子宫右侧角妊娠、稽留流产行清宫术。非近亲婚配，双方无不良遗传病家族史，孕妇子宫发育异常，为不全纵膈子宫。标本采集及各项检查均经患者及家属知情同意并签署知情同意书、伦理学委员会审查通过。

1.2 方法

1.2.1羊膜腔穿刺术 采用超声引导下羊膜腔穿刺技术，抽取30 mL 羊水。其中20 mL 用于细胞培养行染色体核型分析，10 mL 用于提取DNA 行QFPCR 分析和SNP array 检测。

1.2.2G 显带染色体核型分析 用常规方法行羊水和外周血淋巴细胞的培养、收获、固定、核型制备和G 显带。染色体的命名依据《人类细胞遗传学国际命名体制ISCN 2020）》。

1.2.3多重QF-PCR 检测各常见染色体STR 等位基因拷贝数 应用多重QF-PCR 对13、18、21 及X/Y 染色体上的常见STR 位点进行基因拷贝数分析。

1.2.4SNP-array 检测 SNP-array 采用美国Affymetrix CytoSan 750K array 芯片，通过ChASS 2.0软件进行数据分析。

2 结果

2.1 G 显带核型分析结果

胎儿羊水细胞核型分析结果为47，XN，+mar1［86］/48，XN，+mar1，+mar2［14］，即100 个细胞中86 个含有未知来源的mar1（见图1），14 个含有未知来源的mar1 和mar2（见图2）。其中，mar1 是带着丝粒的短臂部分，mar2 结构不清。胎儿父母外周血染色体核型未见异常。

图1 核型：47，XN，+mar1

图2 核型：48，XN，+mar1，+mar2

2.2 QF-PCR 的检测结果

多重QF-PCR 检测发现，21 号染色体有5 个STR 位点的结果异常（见表1），提示染色体近端21q21.1q22.11 区域为嵌合三体，21q22.2q22.3 区域为三体型。

表1 21 号STR 位点与染色体位点的关系

2.3 SNP array 的检测结果

胎儿羊水 SNP array 的检测结果为 arr［GRCh37］21q11.2q22.2（15016487_40158518）×2-3，21q22.2q22.3（40174787_48093361）× 3，即：21q11.2q22.2 区存在25.1 Mb 的正常细胞和三体细胞的嵌合，嵌合比例约35%；21q22.2q22.3 存在7.9 Mb 的三体。

2.4 胎儿的各种产前筛查及检测结果

表2 汇总胎儿的各种产前筛查及产前诊断的检测结果

3 讨论

sSMC 是指结构异常、但仅用传统细胞遗传学的染色体显带不能确定其来源和特征的染色体，其大小通常≤同一中期染色体核型中的20 号染色体［3］。sSMC 是较罕见的细胞遗传现象，在产前诊断中发生率约0.072%-0.98‰［4，5］。sSMC 主要有3 种形态：环状、双着丝粒和带着丝粒的染色体小片段。其中双着丝粒sSMC 最常见，约占63%；其次是带着丝粒的染色体小片段，约占26%；环状最少见，仅占11%［6］。sSMC 携带者具有很强的临床表型异质性，患者可能没有任何症状，也可能表现为发育迟缓、智力障碍、多发性畸形等严重症状据报道，其表型效应与其来源及基因剂量有关［7-9］。因此，确定新发sSMC 的来源及基因剂量是产前诊断的重要内容。本文中胎儿核型为47，XN，+mar1［86］/48，XN，+mar1，+mar2［14］，其双亲的核型正常，故该患儿为新发变异。因此，必需借助其它检测手段以明确其来源及基因剂量。

NIPT 的基本原理是利用大规模平行测序技术分析胎儿游离DNA 片段（cff DNA）在母亲血浆游离DNA 中比例，判断胎儿是否有非整倍体异常；而cff DNA 主要源自胎盘滋养层细胞［10，11］。自2011 年进入临床应用以来，NIPT 已经广泛应用于胎儿常见染色体非整倍体的产前筛查，表现出良好的检测效能，但存在阴性和假阳性，需进一步侵入性产前诊断［12-14］。而侵入性产前诊断中最常用的是羊水染色体核型分析。中孕期的羊水细胞的来源多样，来源于内细胞群的上胚层细胞占羊水培养细胞的大多数，这些细胞相对真实的反映胎儿的遗传物质，可以识别染色体结构和拷贝数（copy number variation，CNV）的异常，一直是产前诊断的“金标准”［15］。但该技术无法识别小于10 Mb 的CNVs，而且存在培养周期长、培养可能失败、可能引起流产及各种并发症的风险［16］。另一方面，羊水染色体核型分析所用的羊水细胞需要经过体外贴壁培养，在培养基中，羊水中具有活力的细胞会贴壁生长，细胞克隆的数量及大小长到一定程度，传代使细胞数量倍增，从接种到收获约10 天，可能会出现选择性的生长偏倚，正常细胞或异常细胞都有可能选择性生长［17］。SNP array 技术是一种较新的染色体芯片技术（chromosomal microarray，CMA），不仅能检出CNVs、大多数的UPD 和低比例的嵌合体，而且适用于多种来源的标本，但无法识别染色体的平衡易位、倒位等结构异常［18-20］。而另一常用的技术，QF-PCR，则是利用短串联重复序列（STR，或微卫星DNA）的分布广泛、信息量大和具有高度遗传的特点，对染色体上的高度多态STR 位点进行检测分析，间接地判断STR 所在区域是否存在CNVs，该技术具有简单、准确、快速和高通量的特点，但也无法识别染色体的结构异常［21-22］。QF-PCR 和SNP-array 技术中所用的全基因组的DNA 直接从羊水细胞中提取，无需细胞培养，可以较真实的反映羊水标本中遗传物质的相对量。

本病例NIPT 提示21 三体高风险，Z 值极高，说明胎盘很有可能存在大量的21 三体细胞，但并不代表胎儿是21 三体。细胞水平的核型分析发现了未知来源的mar1 和mar2，未发现21 三体细胞。而分子水平的两种检测方法，QF-PCR 和SNP-array，均提示21 号染色体的近端为嵌合重复，远端为重复。核型为嵌合体，mar1 是带着丝粒的短臂部分，mar2 结构不清。综合检测结果，可以得出发现：①QF-PCR与SNP-array 的结果基本一致。②细胞水平与分子水平的检测结果存在部分差异：前者提示21 号染色体近端存在三体，而后者提示为21 号染色体的远端存在三体。染色体荧光原位杂交（FISH）有助于明确mar1 和mar2 的结构和真实来源。

核型分析与分子水平的检测结果存在差异，可能存在如下原因：①羊水染色体检查需要进行培养、传代，历时10-12 天，可能存在异常细胞的选择性生长或选择性不长、mar 的丢失等，导致核型结果与体内真实情况存在差异；②mar1 有随体柄的结构，不排除它是21 号染色体的短臂；③mar2 来源不清，有可能为21 号末端的多次重复，导致SNP-array 计算出来是片段三体（需要FISH 验证）；④mar2 的真实比例很高：mar2 无着丝粒，体外培养可能导致mar2的丢失（需要FISH 验证）；⑤21 号末端（21q22.2q22.3）异位或插入到其他染色体而未被发现；其来源有两种可能：父母染色体末端的相互异位、新发突变（需要行高分辨染色体检测或FISH 检测）。

本文病例显示，产前的核型分析与分子水平的QF-PCR 和SNP-array 检测结果存在部分差异，故对于产前诊断的标本，建议同时选用两种以上的方法进行检测，特别是怀疑为嵌合体的病例以及存在结构异常的病例。对于嵌合体的比例的检测，FISH 是金标准；对于sSMC 的来源、比例及断裂位点的确定，也需要FISH 进行验证，本病例应进一步应用FISH 验证标记sSMC 的来源及结构。