HPLC法测定延续接骨丸中芍药苷的含量

孙承浩+谭无名

[摘要] 目的 应用HPLC法测定延续接骨丸中芍药苷的含量。 方法 采用高效液相色谱法测定延续接骨丸中芍药苷的含量。采用色谱柱：Agilent TC-C18（2）5 μm，250×4.6 mm，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85），流速为1.0 mL/min，检测波长230 nm，进样量为5 μL。 结果 芍药苷在0.02514～1.0056 μg范围内，进样量与峰面积线性关系良好（r=0.9997）；平均加样回收率97.43%（RSD=0.79%）。 结论 应用HPLC法测定延续接骨丸中芍药苷的含量操作简便、结果准确、重现性好。

[关键词] 延续接骨丸；牛黄；赤芍；芍药苷；HPLC

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）27-0115-03

延续接骨丸为我市中医院生产的医院制剂，由当归、红花、川芎、延胡索、赤芍、乳香等15味中药材经干燥，粉碎，过筛，混合，每100 g粉末加炼蜜80 g制成大蜜丸，具有活血散瘀，消肿止痛的作用，主要用于治疗跌打损伤，青紫肿痛，闪腰岔气，筋断骨折，瘀血作痛。由于原来的医院制剂标准中没有含量测定项，本文参照《中国药典》2015年版一部、四部，并查阅相关文献[1-6]，采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）定量检测处方中赤芍的芍药苷含量，专属性强，精密度和重复性良好。采用该方法可进一步控制生产中赤芍投料，为延续接骨丸质量监管提供有力的参考依据，现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

岛津2010 CH-T型高效液相色谱仪（包括自动进样器、柱温箱、四元低压泵、紫外检测器等重要组成部分）；BP211-D电子天平。LabAlliance HS3120 超声清洗器。

1.2 试剂

乙腈为色谱纯，乙醇、磷酸为分析纯，芍药苷对照品（批号110736-201640，含量为95.2%）由中国食品药品检定研究院提供。延续接骨丸样品由辽阳市中医药制剂室提供，批号分别为160324、160420、160526。

2 方法与结果

2.1色谱操作条件及系统适用性

采用色谱柱：Agilent TC-C18（2） 5 μm，250×4.6 mm，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85），流速1.0 mL/min，波长230 nm，进样量 5 μL，柱温30℃；

2.2 溶液的制备

（1）样品溶液配制：取样品适量，剪碎，混匀，取样品约3 g，精密称量置于锥形瓶中，加入稀乙醇溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，冷却至室温，再称定重量，将上述混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液（图1）。（2）对照品溶液配制：取芍药苷对照品约20 mg精密称定，至100 mL容量瓶中，加稀乙醇适量溶解，取5 mL上述溶液至20 mL容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度即得（图2）。（3）阴性样品溶液的制备 按工艺方法制备缺少赤芍的阴性样品，并根据“（1）”方法制备（图3）。

2.3 线性关系考察

精密称取芍药苷对照品25.14 mg置于50 mL量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液。精密量取对照品储备溶液0.1、0.2、0.5、1、2、4 mL，分别置于10 mL量瓶中，加稀乙醇或甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件进样，记录色谱图，以进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。回归方程为：Y=12063.5X-19118，r=0.9997（n=6），表明芍药苷在0.02514～1.0056 μg范围内，线性关系良好。

2.4 精密度试验

取50.28 μg/mL芍药苷对照品溶液，进样量为5 μL，连续测定5次，以峰面积计算，RSD为0.8%，说明仪器精密度良好[5，7-10]。

2.5重复性试验

见表1。

2.6稳定性试验

取样品测定项下的供试品溶液在常温条件下放置0、2、4、6 h后分别进样测试，记录色谱图，按峰面积计算，RSD为0.81%，结果表明供试品在常温条件下6 h内稳定性良好。见表2。

2.7 加样回收率试验

取已知含量（0.854 mg/g）的样品6份，精密称定，然后分别精密加入0.2618 mg/mL的对照品溶液5、10、15 mL，再分别精密加入稀乙醇45、40、35 mL，称定重量，超声处理（功率200 W，频率40 KHz）30 min，冷却至室温，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。照样品测定项下方法测定，见表3。

2.8耐用性试验

分别采用3根不同商品规格的色谱柱，对同一批样品按供试品溶液制备方法制备并且依给定测定条件测定含量。见表4。

3 讨论

3.1 提取条件的选择

本试验分别对提取条件进行了下述研究：采用加热回流、超声波提取等方法对提取效率进行考察，实验结果发现超声提取法效率较高；提取溶剂考察了甲醇、稀乙醇溶液，结果发现，提取效果无明显差异；考虑到试剂毒性问题，故选用稀乙醇作为提取溶剂；同时又对稀乙醇用量25 mL、50 mL、100 mL以及提取时间15 min、30 min、60 min进行了考察，最终采用稀乙醇溶液50 mL，超声提取30 min作为提取条件。

3.2流动相的选择

流动相考察了乙腈-水，乙腈-磷酸溶液两种系统，结果发现乙腈-磷酸溶液系统分离较好，同时考察了磷酸的浓度0.05%、0.1%、0.2%对芍药苷分离效果的影响，综合考虑分离度及对液相色谱仪的保护，确定了正文中流动相条件。

综上，采用HPLC法测定延续接骨丸中芍药苷的含量方法操作简便，结果可靠，重现性好，为医院制剂延续接骨丸中赤芍质量的考察提供了参考方法，可作为该制剂的质量控制方法[12-17]。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 2010，一部：96-97.

[2] 柏冬，范斌，牛晓红，等. HPLC-系统内标法测定桂枝汤中芍药苷、橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛和丹参酮ⅡA[J]. 中草药，2010，41（2）：387-390.

[3] 何石兰，法松彬. 高效液相色谱法测定赤芍中芍药苷的含量[J]. 医学信息，2010，23（7）：2342-2343.

[4] 王玲华，邹芃. RP-HPLC法测定三七接骨丸中芍药苷的含量[J]. 药学研究，2015，34（10）：579-580.

[5] 李松，浦香兰. HPLC-DAD法测定接骨丸中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA[J]. 现代药物与临床，2015，30（2）：153-156.

[6] 刘翔，黄京. HPLC法同时测定麻仁丸中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷的含量[J]. 中国药品标准，2010，11（6）：442-446.

[7] 王旭. HPLC法测定马氏接骨丸中白芍普的含量[J]. 内蒙古中医药，2014，33（5）：52-53

[8] 汪芸，陶移文，林慧蓉. HPLC-ELSD测定黄芪破壁饮片中黄芪甲苷的含量[J]. 中国现代医生，2013，51（17）：95-96，121.

[9] Kaur S，Modi NH，Panda D，et al. Probing the binding site of curcumin in Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ-a structural insight to unveil antibacterial activity of curcumin[J]. Eur J Med Chem，2010，45（9）：4209-4214.

[10] Artola MRuiz-Avila LB，Vergonos A，et al. Effective GTP-replacing FtsZ inhibitors and antibacterial mechanism of action[J]. ACS Chem Biol，2015，10（3）：834-843.

[11] Park YS，Grove CI，Gonzalez-Lopez M，et al. Synthesis of （-）-viriditoxin：A 6，6-binaphthopyran-2-one that targets the bacterial cell division protein FtsZ[J]. Angew Chem Int Ed Engl，2011，50（16）：3730-3733.

[12] 薛改进，赵云丽，郝杰，等. HPLC 法同时测定抗敏颗粒中芍药苷、毛蕊异黄酮苷和阿魏酸的含量[J]. 中国药房，2010，21（23）：2168-2170.

[13] 孔铭，朱玲英，王佩娟，等. HPLC 测定补肾活血颗粒中芍药苷，阿魏酸，淫羊藿苷的含量[J]. 中成药，2010，32 （4）：600-603.

[14] 陈春水，庞晓华. RP-HPLC法测定当归芍药散中芍药苷的含量[J]. 药物研究，2008，5（13）：30-31.

[15] 王世祥，王晓雯，高志娟，等. HPLC 法测定活血胶囊中芍药苷、苦杏仁苷、川芎嗪和阿魏酸[J]. 中成药，2011， 33（4）：619-620.

[16] Chen LL，Qi J，Chang YX，et al. Identification and determination of the major constituents in Traditional Chinese Medicinal formula Danggui-Shaoyao-San by HPLC-DAD-ESIMS/MS[J]. J Pharm Biomed Anal，2009， 50（2）：137.

[17] 李向阳，屠万倩，张留记. RP-HPLC 法测定不同产地的牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的含量[J]. 中药新药与临床药理，2011，22（5）：563-565.

（收稿日期：2016-06-28）