羊肚菌衰老特性的测定分析

刘 伟 何培新 蔡英丽 马晓龙 赵 雄

羊肚菌衰老特性的测定分析

刘 伟1，2*何培新3蔡英丽1马晓龙1赵 雄4

（1. 武汉市农业科学院蔬菜研究所，武汉 430345；2. 西南林业大学 应用真菌研究所，昆明 650224；3. 郑州轻工业大学食品与生物工程学院，郑州 450001；4. 武汉菇巴克农业科技有限公司，武汉 430070）

应用野生高羊肚菌（）及3种可驯化栽培的梯棱羊肚菌（）、六妹羊肚菌（）和七妹羊肚菌（）的15个样品共计52个分离株，包括相同子囊果不同部位和相同部位的多个组织分离株，以及单孢分离株，采用继代培养的方法测定这些菌株的生长曲线和形态特征，分析这些菌株的菌丝生长速度、菌核和色素产生及菌落形态等培养性状。结果为：除了两个组织分离菌株在继代培养5 320 h仍然存活以外，其余供试菌株均在不同时间段内老化死亡，其中寿命最长者为连续继代培养3 814 h，继代培养总生长距离213.7 cm；寿命最短者仅继代培养360 h，总生长距离5.9 cm。羊肚菌的老化表型为菌核产生数量下降、产生色素增加、菌丝生长速度下降和菌落边缘不整齐。表明羊肚菌菌丝的快速老化是一个普遍现象，可能与低等生物遗传物质的快速变异有关。鉴于菌株老化严重影响栽培产量，建议将菌株寿命测定作为羊肚菌优质菌种评判的一个指标。并提出在生产中减缓羊肚菌老化的一些措施。

老化；继代培养；菌株寿命；菌种质量；菌核；色素

羊肚菌（spp.）是一类名贵的食用菌，受到全球蘑菇爱好者的追捧[1]。近年来，中国的羊肚菌人工栽培领先国际取得了长足的进展，栽培面积也逐年激增[2, 3]。然而，羊肚菌产业快速发展的背后是每年有70%的种植者无法稳定盈利，其中菌种技术是决定栽培成败的关键因素之一[4]。老化（Aging）是所有生物都规避不了的自然生理过程，涉及凋亡、自噬、坏死等多种基础生物学事件，彼此交叉互作，受到精细的遗传调节，并与环境条件和细胞发育密切相关[1, 5, 6]。

与多数高等担子菌不同，子囊菌似乎更易老化。研究较多的子囊菌有柄孢壳[7]（）、粗糙脉孢霉（）[8]、白僵菌（）[9]和绿僵菌（）[10]等。Hervey等[11]发现普通羊肚菌（）部分子囊孢子萌发后存在生长停滞现象，但作者未就菌丝生长停滞原因深入研究。衰老是涉及到自噬和凋亡的系统性不可逆过程[12]。我们深入研究高羊肚菌（）的衰老特性，发现其在继代培养过程中会发生明显的老化现象，不同菌株老化的宏观和微观特征不同。随后我们测定了梯棱羊肚菌（）和六妹羊肚菌（）系列继代培养菌株的培养性状和栽培特性，发现随继代培养代数增加老化增强，两菌株的脂质过氧化程度增加，菌核产生能力下降，色素形成加剧，栽培产量持续下降。梯棱羊肚菌T4菌株在继代培养的第6代，六妹羊肚菌T6菌株在继代培养的第2代时，栽培产量下降到原代菌株的50%[5]。菌株老化严重影响羊肚菌的栽培产量。

然而，由于缺乏关于羊肚菌老化的大样本系统性研究，菌株老化是否是羊肚菌的普遍现象，不同种类羊肚菌的菌株老化特征是否存在差异等问题无法定论。本文针对4种羊肚菌的15个不同样品，共进行52个组织和单孢分离菌株的老化性状测定，分析比较不同部位和相同部位的组织分离株及单孢分离菌株的老化性状，以期为羊肚菌菌种质量评价提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株的选择

以野生高羊肚菌及可人工栽培的梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌4种羊肚菌子囊果标本的组织分离株和单孢分离株为实验材料，以第一代分离株作为原代菌株。组织分离和单孢分离方法参见文献[13]。所有供试样品均通过ITS、LUS、RPB和EF片段的序列分析技术以确定其分类地位[1, 14]。

样品编号说明：14-An-a/b/c和15-Zh1-a/b/c为14-An和15-Zh1两个分离株的3次生物学重复；MG04和MB04分别为同一子囊果的菌盖和菌柄部位组织分离株；18-114-M03A、18-114-M01B及18-114-M05A为18-114标本的3个单孢分离株；其他菌株均为组织分离株。标号末尾的不同编号数字代表相同部位（菌柄）组织分离时不同组织块萌发的分离株，如17-17-1和17-17-3分别是编号17-17样品的同一菌柄组织分离的不同组织块的萌发株。M4-1U和M4-3U采用U型管培养测定；其他菌株均采用直径15 cm的大培养皿培养测定。M4-1M使用复合培养基（麦粒48%，木屑48%，石灰1%，石膏1%，含水量65%），其他菌株均使用CYM固体培养基。

1.2 继代培养

继代培养采用直径15 cm培养皿或自制U型管，U型管由直径2.5 cm、长40 cm的玻璃管两端各5 cm 以45°弯折而成。在培养皿或U型管内倒入CYM固体培养基（葡萄糖 20 g，酵母膏 2 g，蛋白胨 2 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，KH2PO40.46 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 L），其中15 cm大培养皿倾倒约40 mL，U型管倒入35 mL。待培养基冷却凝固后接种，在培养皿的一边或U型管的一端接种原代菌株菌种块，23 ℃下培养。每隔3天在菌落前端划线标记；当菌落生长至培养皿的另一边或U型管的另一端前，用接种针切取菌丝前端0.3 cm × 0.5 cm的组织块（包含完整的尖端菌丝细胞），按照菌丝生长的方向，置于新的培养皿或U型管内。如此反复，直至菌丝衰老死亡。

同一个样品整个实验过程只使用一种规格的大培养皿或U型管，实验过程避免菌落长满培养皿或长至U型管另一端。每一次转接称为一个世代，在转接时保留一份培养物接种于新的CYM斜面试管作为继代培养中间过程菌株，培养7～10天后保藏。详细的继代培养过程可参见文献[15, 16]。

1.3 数据统计和分析

将继代培养过程中的菌株活化后接种于直径9 cm的CYM培养皿，23 ℃培养，在第3天、6天、9天和14天时观察并记录菌丝的长势、浓密程度，菌落形态特征，菌核发生的时间和数量，色素产生的时间及状态；在第14天时，对培养物进行拍照。每菌株进行3次重复试验。

生长曲线的绘制：在继代培养过程中，每3天测量一次菌丝生长距离，计算该区间的菌丝生长速度，并以此绘制生长曲线。统计每一菌株在完整的继代培养中的总培养时长和总生长距离。

2 结果与分析

2.1 菌株老化的培养特征

不同供试菌株培养的老化特征比较相似。随菌株老化程度增加（继代培养时间延长），供试菌株的菌核减少，色素增多，菌丝生长减慢。He等[12]依据羊肚菌菌落的宏观、微观特征，将典型的衰老分为健壮、衰老前、衰老三个阶段。图1为18-114-1菌株6个不同继代培养物的宏观特征（该菌株在CYM培养基上没有明显的菌核产生），在健壮阶段（图1a，b）菌落生长均匀、菌落前端整齐，无明显的色素产生；而从第3代开始出现轻微的色素，即到了衰老前阶段；随着继代进程的延续，色素产生持续增强，在继代培养至第5代时达到最强，整个培养皿培养物均呈棕色；直至最终（第6代）彻底死亡。衰亡阶段的培养物生长速度迅速下降，无法长满培养皿，菌落前端不整齐，菌落整体呈不规则形状。而一些产生明显菌核的菌株，则表现为在健壮阶段菌核数量和形态无明显的变化或仅数量轻微减少；而在衰老前阶段则随着继代培养的延续，菌核数量明显下降，直至无菌核产生。

图1 18-114-1菌株连续6代继代培养物的宏观特征

注：a、b为健壮阶段，初始菌落边缘整齐，色素少；c、d、e为衰老前阶段，随着继代次数的增加，色素增加；f为衰老死亡阶段，菌丝生长速度下降明显，菌落边缘不整齐，菌落呈不规则形状。

2.2 不同菌株的寿命及衰老特性

本实验发现，所有供试菌株中，除两个七妹羊肚菌分离株19-33-4和19-33-10在连续培养5 320 h后仍旧健壮生长外，其他菌株均在有限时间内死亡（表1）。在已衰亡的菌株中，寿命最长的为15-Zh4菌株，连续培养3 814 h，培养总长度为213.7 cm；寿命最短的菌株17-17-1在培养360 h内死亡，菌丝生长总长度仅为5.9 cm。实验中，我们以香菇（）商业菌株808和135（非原代组织分离菌株）作对照进行相同的连续继代培养，在连续培养16个月内，未出现生长速度下降现象，菌丝密度和菌丝爬壁能力也和原代菌株基本一致。这和生产的经验趋同，作为子囊菌的羊肚菌比担子菌类食用菌具有更快的衰老速度[1]。大部分高羊肚菌（n=30，83%）和六妹羊肚菌供试菌株（n=4，100%）的寿命低于所有供试菌株的平均寿命（2 033 h），似乎表明高羊肚菌具有更易老化的特性。其他六妹羊肚菌菌株是否也如本实验菌株一样容易老化，还有待增加实验材料加以确证。

表1 不同羊肚菌分离菌株的老化性状

菌丝长速是菌株在继代培养老化过程中的一个明显可量化的指标。两个典型的继代培养生长速度变化曲线见图2，在健壮阶段和衰老前阶段，菌丝的长速没有显著的变化，趋于平均值持续生长；而在衰老阶段，菌丝生长速度则急剧下降，在一个培养世代内（～240 h）迅速死亡。

图2 高羊肚菌4个菌株继代培养生长速度变化曲线

为了探究羊肚菌不同继代菌株的生长潜能和稳定性，对高羊肚菌M4-2和M4-3菌株的不同继代培养物进行新轮次的继代培养。结果表明，两菌株的表现趋于一致。虽然靠前的两个世代菌株（M4-2-1与M4-2-2，M4-3-1与M4-3-2）的寿命（总生长距离）和亲本趋同（图3），但越接近衰老阶段的继代培养物，其新轮次继代培养老化的速度越快（图4）。这些结果表明，继代培养逐渐趋于老化是羊肚菌的一种稳定性状。

图3 M4-2和M4-3不同继代菌株新轮次继代培养的寿命

图4 M4-2和M4-3不同继代菌株新轮次继代培养生长曲线

2.3 不同组织分离株和单孢分离株的衰老表型

同一个子囊果的不同部位组织分离菌株，甚至相同部位的多个组织块萌发分离株，其老化特征都不尽相同。例如，MG04和MB04分别是同一个子囊果的菌盖和菌柄组织的分离株，虽然两者的平均生长速度相近，但其连续继代培养特征不同，表现为继代培养次数和最终寿命的差异，其中MG04-1和MG04-2分离株的总培养时长分别为2 520 h和1 822 h，而MB04-1、MB04-2和MB04-3的总培养时长则分别为1 512 h、3 814 h和863.5 h。此外，同一个子囊果相同部位（菌柄组织）的不同组织块的组织分离菌株的寿命也不尽相同（表1）。这种现象在多个样品的分离株继代培养中均存在，如17-19、17-20、17-21、17-22和17-23等5个样品的各自不同组织分离株的继代培养中，没有任何两个组织分离株表现出一致的寿命；而17-17-1和17-17-3两个分离株的菌丝总生长距离相差近10倍（表1）。

单孢分离菌株也具有快速老化的特性，表现出有限寿命。18-114-M03A、18-114-M01B和18-114-M05A分别是18-114菌株的3个单子囊孢子分离菌株。这3个单孢菌株的平均长速近似（0.51～0.52 mm/h）；但寿命不同，最短的744 h，最长的997 h，均短于18-114-1组织分离株的寿命1 319 h（表1）。

3 讨 论

同一子囊果不同部位（菌柄和菌盖）的分离株、同一部位（菌柄）的不同组织分离株、不同的单孢分离株之间表现出不同的老化性质，暗示羊肚菌子囊果不同组织细胞（包括子囊孢子）具有不同的生理和遗传状态。丝状真菌菌丝以顶端生长的方式进行，菌丝最前端的细胞核在顶端细胞中发生有丝分裂，随后隔膜在顶端细胞和亚顶端细胞之间形成，将部分细胞核割裂在顶端细胞内继续进行新的有丝分裂，实现多核细胞结构，依次形成新的细胞[17]；虽然隔膜孔的开合允许细胞器在细胞间流动，快速生长的顶端细胞在持续的有丝分裂后可能就具有了后端细胞“不同”的细胞核遗传物质（错配修复、突变积累等导致的碱基突变的增加）。

本实验严格进行尖端细胞的继代培养，最大程度地确保菌丝一直朝一个方向生长。理论上，经过一定世代后，前端的菌丝细胞就有可能已经和后端有所不同，这可能是造成供试材料在实验条件下发生明显的快速老化的一个原因；而对照的担子菌香菇菌株则一直没有出现老化迹象。子囊菌中的柄孢壳、粗糙脉孢霉、白僵菌等也有快速老化的特性[7-9]。因此我们推测，作为一种大型子囊真菌，羊肚菌的快速老化是这一物种的本性。

本研究供试的大部分菌株，随着继代培养的延续，老化程度显著加剧，特别是在供试高羊肚菌和六妹羊肚菌菌株中，平均寿命均偏低。此外，栽培试验表明，人工栽培的产量与继代培养代数呈显著负相关，随继代培养代数的增加，产量急剧下降[5]。生产中肆意扩繁会造成菌丝纤细、菌丝活力下降，产量降低。以上结果表明，测定即将用于商业化生产的菌株生长曲线，了解其老化特性，选择不易老化的菌株进行推广应用，对羊肚菌高产和稳产具有一定的指导意义。

虽然目前还无法限定一个潜在高产菌株的最短寿命标准，但是依据生产经验，倾向于认定营养生长2.5个月（生产中最短1个月可以出菇，但短的营养生长时间不利于营养的转化和储备，不利于高产）仍未出现明显老化症状的菌株为潜在优良菌株。若菌株出现了菌丝纤细、菌落不整齐、色素增加、菌核量下降和/或菌丝长速下降时，可初步判定发生了衰老事件，不能用于生产。

不利的环境因素如高温、富营养容易造成菌株老化。因此，在菌种生产过程中，以低于23 ℃的低温培养为宜。培养温度偏高，菌丝生长纤细，色素分泌加剧，菌核量少，甚至不产生菌核。在大田生产中，可通过低温播种、遮阳棚遮阳等措施，营造低温发菌和养菌环境。营养富足也是一个容易诱发衰老的外因。生产经验表明，在纯小麦、纯玉米芯或过高比例的小麦栽培种培养基上培养，羊肚菌菌丝较易产生色素，不易形成菌核。另外，连续继代培养代数过多、接种物比例过小、不科学的菌株保藏方法、保藏时间过长等也易加剧老化，影响商业栽培。

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国家食用菌产业技术体系项目（CARS-20）；湖北省重点研发计划项目（编号2020BBA041）

刘伟（1984—），男，博士，主要从事食用菌遗传育种研究。

，E-mail：zhenpingliuwei@163.com。

Q93-3，S646

B

2095-0934（2021）01-044-06