向日葵核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌核菌丝型萌发特性

唐仕娟，刘 佳，郭子坤，石成才，王智飞，张树武，徐秉良

(甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，兰州 730070)

向日葵(HelianthusannuusL.)由于其籽实含油量高及其秸秆可作为生物能源，已成为世界第四大油料作物[1-3]，全世界年产量达4734.5万t，中国种植总面积为95.902万hm2。由于诸多病害的发生，向日葵产业发展受到严重限制，其中由核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的菌核病是造成向日葵产业经济损失的主要病害之一，世界各地向日葵种植区均有发生[4]。研究表明，核盘菌可以侵染向日葵叶片、茎基部、根部和花盘等部位，花盘受害后品质下降，产量降低，损失严重[5-6]。据报道，在中国向日葵菌核病发生地块，一般可减产30%左右[7]。民勤县作为甘肃省向日葵主栽区，近年来菌核病发生愈来愈严重，如2016年该病导致民勤县向日葵减产10%～30%，个别严重地块减产高达80%[8]。

研究表明，菌核作为向日葵菌核病菌度过不良环境的重要形态[9]和主要初侵染源，在干旱土壤中可存活8a之久[10]。Hao等[11]发现菌核侵染寄主的主要方式有直接萌发形成菌丝体侵入植物内部，以及萌发形成子囊盘后释放出子囊孢子，并借助媒介侵入寄主植物。有关菌核萌发形成子囊盘的报道较多，于淑怡等[12]研究表明，温度和湿度适宜时菌核可萌发出子囊盘柄，光照条件下菌核可萌发形成成熟的子囊盘。Mila等[13]研究表明，土壤中的水分是影响菌核子囊盘型萌发的重要因素，土壤干燥时菌核无法萌发形成子囊盘。Nepal等[14]研究表明菌核吸水量与其子囊盘的萌发密切相关，当含水量较高时，菌核的萌发率越大，形成子囊盘数量也越多。同时，菌核可直接萌发形成菌丝侵入植物内部，韩月泠等[15]发现人参核盘菌菌核在自然条件下容易直接萌发出菌丝，但未吸收水分时无法萌发形成菌丝，土壤湿度对其萌发菌丝影响较大。母红岩等[16]发现土壤湿度越小、菌核龄期越大越不利于其直接萌发形成菌丝。Huang等[17]研究发现菌核土壤中进行菌丝萌发，产生的菌丝可以感染向日葵幼苗的根和下胚轴，而其花盘部分感染是由子囊孢子引起的。另外，在自然环境中菌核形成极易受湿度、温度和通风情况等环境因素影响[18]，营养、光照和pH等条件是齐整小核菌菌核形成的关键因素[19]。

影响向日葵菌核病菌菌核萌发特性及菌核形成的主要因素尚未报道，本研究以从甘肃民勤向日葵种植地区分离的核盘菌形成的菌核为研究对象，探究不同条件对向日葵菌核菌丝型萌发和菌丝型萌发后形成菌核的影响，旨在为菌核病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

将采集、分离自甘肃民勤并保存于甘肃农业大学植物保护学院植物病毒学与分子生物学实验室的核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)接种于PDA平板中央活化培养2 d后(25 ℃恒温培养箱，12 h/d光照培养)，挑取培养基边缘菌丝转接于新的PDA平板，待培养14 d后(菌核成熟)挑选大小一致菌核取出晾干，室温保存，备用。

1.2 方 法

1.2.1 菌核消毒处理 菌核用75%酒精浸泡 15 s，转移至4%NaClO溶液浸泡3 min，无菌水重复漂洗3次，无菌滤纸吸干表面水分，收集， 备用。

1.2.2 温度对菌核菌丝型萌发活性及菌核产生量影响 将消毒处理的菌核接种于PDA培养基中央，每皿接种1个菌核，并分别置于温度为5、10、15、20、25、30、35和40 ℃培养箱中黑暗培养。待培养3 d后，观察菌核萌发形成菌丝的情况，每隔1 d测量菌落直径，培养14 d后记录菌核数量。每个处理3皿，重复3次。

1.2.3 pH对菌核菌丝型萌发活性及菌核产生量影响 制备pH分别为4、5、6、7、8、9和10的PDA培养基，将菌核接种于不同pH PDA培养基中央，每皿接种1个菌核。置于光照培养箱(温度为25 ℃、光照时长为12 h/d)培养。菌核萌发、菌落直径及菌核数量记录方法同“1.2.2”，每个处理3皿，重复3次。

1.2.4 不同光照条件对菌核菌丝型萌发活性及菌核产生量影响 将菌核置于 PDA 培养基中央，每皿接种1个菌核，分别置于不同光照条件培养(24 h/d光照、0 h/d光照、12 h/d光照、紫外照射2 h+24 h/d光照、紫外照射2 h+0 h/d光照)。菌核萌发、菌落直径及菌核数量记录方法同“1.2.2”，每个处理3皿，重复3次。

1.2.5 不同碳源、氮源对菌核菌丝型萌发活性及菌核产生量影响 根据Czapek培养基的配方，按照相同的比例加入不同种碳源，分别以蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖和甘露醇作为碳源，以硝酸钠、硝酸铵、尿素、硝酸钾、蛋白胨和氯化铵作为氮源制备不同碳源和氮源培养基，并以不添加碳源、氮源培养基作为对照。然后，将备用菌核置于 PDA 培养基中央，每皿接种1个菌核，置于培养箱(温度为25 ℃、光照时长为12 h/d)培养。菌核萌发、菌落直径及菌核数量记录方法同“1.2.2”，每个处理3皿，重复3次。

1.2.6 温度对菌核致死活性的影响 采用恒温水浴处理法测定温度对菌核致死活性的影响。将菌核置于装有5 mL无菌水的10 mL无菌离心管中，并利用水浴锅对其进行不同温度处理，处理温度分别为45、50、55、60、65、70、75和80 ℃，处理时间为10 min。经处理后置于无菌滤纸晾干，并接种于PDA平板中央，每皿接种1个菌核，每个处理5皿。分别置于25 ℃、光照时长为12 h/d的培养箱中培养，培养3 d后观察菌核萌发情况，每隔1天观察1次，连续观察7 d。

1.3 数据处理和分析

采用Excel 2010整理数据并绘制图表，采用SPSS 21.0软件和Duncan’s新复极差法进行统计分析及多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 温度对菌核菌丝型萌发后菌落生长及菌核产生量影响

结果表明，在5～30 ℃时菌核均可进行菌丝型萌发，最适宜菌核菌丝型萌发和菌丝生长的温度为20～25 ℃，培养6 d后菌核萌发菌丝形成的菌落直径均可达85 mm。温度对形成的菌核大小和数量均有影响，在适宜温度范围内培养形成的菌核数量较多，其中25 ℃下培养所形成的菌核数最多。当温度低于20 ℃时形成的菌核数量会减少，然而，形成的菌核较大，直径可达6 mm左右；当培养温度为30 ℃及以上时无法形成菌核(表1)。

表1 不同温度下菌核菌丝型萌发及形成菌核情况Table 1 Germination of hyphae from sclerotia and sclerotia formation of S.sclerotium at different temperatures

2.2 pH对菌核菌丝型萌发活性及菌核产生量的影响

培养基pH在4～10时菌核均可进行菌丝型萌发，且随着pH增大，菌核萌发时间越长，菌落生长速度越慢(图1-A)。培养基pH在4～9时菌核萌发菌丝后均可形成菌核，且随着pH的增大形成的菌核数逐渐减少。当培养基pH为4时形成的菌核最多，且与pH ≥ 5的处理间均存在显著差异，pH为10时，菌核萌发菌丝后无法形成菌核(图1-B)。

2.3 光照对菌核菌丝型萌发活性及菌核产生量的影响

光照时长对菌核菌丝型萌发及菌核形成有显著影响，光照时间越长菌核萌发后菌丝生长速度越快，在24 h/d光照培养时，菌落生长速度最快，黑暗培养的菌落生长最慢。紫外照射对菌核的菌丝型萌发无显著抑制作用(图2-A)。24 h/d光照培养形成的菌核数量最多，平均每皿可形成18个菌核，与其他处理间差异显著。紫外照射后形成的菌核数略少于未经紫外照射的处理(图2-B)。

2.4 碳源对菌核菌丝型萌发活性及菌核产生量的影响

结果表明，添加不同种类的碳源对菌核菌丝型萌发活性和萌发后菌核的形成有显著影响。培养4 d、5 d和6 d后，与对照相比，蔗糖、葡萄糖、甘露醇和乳糖做碳源时，菌核萌发后菌落直径均与对照差异显著(图3-A)。添加乳糖作为碳源时，形成的菌核最多，平均每皿可形成14个菌核，显著高于添加其他碳源。然而，添加甘露醇为碳源时，形成的菌核数量与对照相比无显著差异，均形成少量菌核(图3-B)。

2.5 氮源对菌核菌丝型萌发活性及菌核产生量的影响

结果表明，氮源的种类对菌核菌丝型萌发活性和萌发后菌核的形成有显著影响。蛋白胨是最适宜菌核萌发后菌落生长的氮源，且在培养4 d和5 d 后，形成的菌落直径显著高于其他组处理，而尿素作为碳源时，菌落直径均显著小于其他组处理(图4-A)。添加硝酸铵为氮源时形成的菌核最多，平均每皿可形成24个菌核，形成的菌核数量显著高于其他处理。不添加氮源时无法形成菌核，添加尿素为碳源时，形成的菌核数量与对照间无显著差异，仅形成少量菌核(图4-B)。

2.6 温度对菌核致死活性的影响

结果表明，不同温度处理后培养7 d对菌核致死活性具有显著影响，其中当水浴处理温度为45 ℃和50 ℃时，菌核萌发形成的菌落直径达85 mm。水浴处理温度大于50 ℃对菌核的萌发具有显著影响，在水浴处理温度为55 ℃、60 ℃、 65 ℃和70 ℃时，菌落直径分别为25.83 mm、20 mm、12.33mm和0 mm，显著小于45 ℃和50 ℃处理后培养的菌落直径，尤其当温度为70 ℃处理10 min时，菌核未能萌发形成菌丝(图5)。

3 结论和讨论

本研究发现在5～30 ℃时菌核均可进行菌丝型萌发，最适宜其萌发的温度为20～25 ℃，35 ℃及以上温度培养时，菌核无法进行菌丝型萌发，且10 ℃及以下温度培养时，菌核萌发菌丝较慢，培养5 d才可见菌核萌发形成菌丝。母红岩等[16]研究表明油菜菌核菌丝型萌发的最适温度为20～27.5 ℃，10 ℃以下和30 ℃以上均不利于菌核进行菌丝型萌发，与本研究结论基本一致。李国庆等[12]研究表明，不同温度下生长的菌核萌发具有多样性，本研究中温度对菌核菌丝型萌发的速度和萌发后形成的菌核数量及大小有显著影响。本研究中低温下菌核可进行菌丝型萌发，而母红岩等[16]的研究中，在第11天时，10 ℃培养的菌核未见萌发，这可能与菌核的来源和本研究为菌核提供营养刺激(即在培养基上培养)有关。

有研究[20]表明，核盘菌分泌的草酸是其致病过程中的重要因子，为核盘菌侵染提供酸性环境，因而核盘菌对pH的适应能力较为广泛。本研究发现菌核菌丝型萌发对pH的适应范围也较为广泛，在培养基pH为4～10时菌核均可进行菌丝型萌发，酸性条件更有利于菌核进行菌丝型萌发，这与母红岩等[16]研究结果一致。随着pH增大，菌核数量越来越少，当培养基pH为10时，菌核进行菌丝型萌发后无法再形成菌核，这与Rollins 等[21]报道碱性条件下菌核形成受到抑制的结论一致。

刘勇等[22]研究报道，紫外线照射能够刺激菌核子囊盘型萌发，本研究中发现紫外光照射对菌核的菌丝型萌发没有显著刺激作用。同时本研究发现光照时间越长菌核越容易进行菌丝型萌发。相关研究表明菌核的坚固结构可以抵御外界不良环境，例如：紫外线照射、高温、干旱等[23]，本研究发现紫外光照射2 h后菌核仍可进行菌丝型萌发，这可能与菌核的结构有关。

关于碳源和氮源对菌核菌丝型萌发的研究较少，本研究中培养基不添加碳源和氮源时菌核均能进行菌丝型萌发，但不添加碳源或氮源时，几乎无法形成菌核。部分碳源和氮源会抑制菌核菌丝型萌发后形成菌核，如甘露醇和尿素，其原因有待进一步研究。另外，菌核对不良环境因素有一定的耐受力，本研究中向日葵菌核的致死温度高达70 ℃(水浴10 min)，与王玮[24]研究的辣椒菌核病菌形成菌核的致死温度相同。因此，本研究明确了不同温度、pH、光照条件、碳源和氮源对向日葵菌核菌丝型萌发的影响，但其他因素促使菌核菌丝型萌发的条件和机理有待进一步研究。