浮游真菌对工厂化生产金针菇菌丝生长的影响试验

蔡 婧 常堃 边银丙 肖 扬*

浮游真菌对工厂化生产金针菇菌丝生长的影响试验

蔡 婧1，2常堃1，2边银丙1肖 扬1*

（1. 华中农业大学应用真菌研究所，武汉 430070；2. 十堰市农业科学院，湖北 十堰 442000）

采集金针菇工厂洁净区域的浮游真菌样本，通过对峙培养和真菌侵染性试验观察其对金针菇菌丝生长的影响。结果：小孢根霉（）、哈茨木霉（）、棘孢木霉（）、伞枝犁头霉（）、黑曲霉（）、黄曲霉（）、马菲氏青霉菌（）、尖孢枝孢霉（）、白囊耙齿菌（）、裂褶菌（）、撕裂蜡孔菌（）及串珠镰刀菌（）等12种浮游真菌的菌丝生长速度快于或等于金针菇，对金针菇菌丝生长影响较大。其中哈茨木霉还能在已被金针菇菌丝封面的培养基上生长，具有竞争和侵染的双重特性。

工厂化；金针菇；洁净区；浮游真菌；对峙培养；菌丝生长

金针菇又名冬菇，富含精氨酸、赖氨酸、锌等益于儿童智力发育的活性物质，营养价值高，味道鲜美，是我国工厂化生产的主要菇种之一[1-3]。为了降低杂菌基数和栽培瓶感染杂菌的风险，金针菇工厂的冷却室和接种室设计成洁净室，采用封闭式管理，通过空气净化设备防控杂菌的侵入。但洁净室内的换气次数、发尘量、压差控制、过滤器效率等会影响室内洁净度，其环境中不可避免存在一些微生物污染源。本研究对金针菇工厂的接种室、冷却室等洁净区域进行浮游真菌采样，研究灭菌后、接种前的环境中浮游真菌与金针菇菌丝生长的关系，为生产企业制定有效的消毒措施、降低污染率提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 浮游真菌的采集

2013年5～9月，使用mas-100 eco固体撞击式浮游菌采样器，分别对冷却室和接种室空气中的微生物进行样本采集，采样高度距地面1.0 m，采样器空气流量为100 L/min，采样时间7 min。采样时，冷却室中放入第一批处于高温的灭菌培养料，设置11个采样点。接种室有3台接种机，两名固定工作人员，采样时间为接种时段，设置7个采样点。样本培养基采用SDA（sabouraud dextrose agar）培养基，培养皿直径9 cm。采样后，SDA平板在（25±1）℃条件下培养5～7天。

观察平皿中菌落的培养情况，不断挑取单一的菌落转接、分离、纯化，经多次纯化后得到纯培养物。此时培养皿内只存有单一的菌落形态。挑取纯培养的菌块接种至装有PDA培养基的试管内，待长满试管后，于4 ℃保藏备用。

1.2 分离微生物的鉴定

对分离菌株的ITS基因序列进行测定，将得到的序列结果提交至NCBI核酸数据库进行Blast比对，按照与GenBank中已知序列相似性大于99%为相同种[4]的标准，鉴定分离菌株的种类。

1.3 金针菇菌丝与浮游真菌共同培养

采用PDA培养基培养金针菇与分离物，将按照文献[5]的方法配制的培养基装于25×200（mm）双头试管中，121 ℃灭菌1.5 h。采取以下两种方法检验分离物对金针菇菌丝生长的影响。

（1）试管对峙培养试验。在双头试管的一头中接入直径约7 mm的金针菇菌块，于25 ℃恒温箱内避光培养10天后，在试管另一头接入直径约7 mm的分离物菌块进行对峙培养，对照组为接入另一直径约7 mm的金针菇菌块，依然置于25 ℃恒温箱内避光培养。观察两种菌丝交界情况。

（2）真菌侵染性试验。在试管中接入直径约7 mm的金针菇菌块，于25 ℃恒温箱内避光培养15天后，挑出金针菇接种菌块，在同样位置接入直径约7 mm的分离物菌块，依然置于25 ℃恒温箱内避光培养。观察分离物即浮游真菌能否在已被金针菇菌丝封面的培养基上生长。

2 结果与分析

2.1 试管对峙培养表现

在洁净区环境中共分离得到24种真菌（表1）。其中，棘孢木霉（）和小孢根霉（）的菌丝生长速度较快，在接种后第5天就与金针菇菌丝交界，比对照早10天；哈茨木霉（）和伞枝犁头霉（）的菌丝在接种后第10天与金针菇菌丝交界，也快于对照；黑曲霉（）、黄曲霉（）、马菲氏青霉菌（）、尖孢枝孢霉（）、白囊耙齿菌（）、裂褶菌（）、撕裂蜡孔菌（）及串珠镰刀菌（）等8种浮游真菌的菌丝在接种后第15天与金针菇菌丝交界，与对照相似；其他12种浮游真菌菌丝均在接种后15天以上才与金针菇菌丝交界。

2.2 真菌的侵染性表现

在金针菇菌丝已封面的培养基上重新接种24种浮游真菌进行侵染性试验的结果，仅哈茨木霉菌丝能够生长（图1上）。在接入哈茨木霉菌块7天后，其菌丝覆盖了金针菇菌丝，并产生大量孢子。包括马菲氏青霉菌（图1下）在内的其他真菌均不能在金针菇菌丝已封面的培养基上生长。

表1 金针菇与浮游真菌试管对峙培养的菌丝交界所需时间

图1 浮游真菌对金针菇侵染性试验结果

注：上面箭头所示为哈茨木霉，能生长；下面箭头所示为马菲氏青霉，不能生长。

3 结论与讨论

从试管对峙培养结果看，小孢根霉、伞枝犁头霉、棘孢木霉和哈茨木霉的菌丝生长较快，易感染封面前的金针菇菌丝，危害较大。黄曲霉、黑曲霉、马菲氏青霉菌、尖孢枝孢霉、白囊耙齿菌、裂褶菌、撕裂蜡孔菌及串珠镰刀菌的菌丝生长速度与金针菇菌丝生长速度不相上下，也有可能感染培养料。

根霉属真菌的菌丝生长迅速，易感染用于食用菌栽培的棉籽壳培养基和小麦培养基[6]。伞枝犁头霉是毛霉目、梨头霉属的丝状真菌，主要分离于醋曲样本[7]，其生长速度快，竞争性强。曲霉不仅和食用菌争夺养分，还会分泌毒素抑制食用菌菌丝生长，最终导致栽培料报废[8]。青霉菌能抑制食用菌菌丝生长，一旦覆盖食用菌菌丝体，将导致无法出菇[9]。青霉主要在食用菌菌丝生长阶段发生为害[8]。互隔交链孢霉能引起多种植物病害，寄主范围非常广泛，包括谷类、蔬菜、油料作物、观赏植物和水果等[10]，感染食用菌会引起食用菌培养料腐败，使食用菌菌丝无法生长[8]。串珠镰刀菌可引发植物根腐、茎腐、穗腐等症状[11]，也会引起平菇枯萎病[12]。以上真菌对食用菌生产均存在一定危害性。

枝孢属真菌分布广泛，几乎存在于任何环境，一些枝孢属真菌可侵染植物的枝条、叶片和果实，引起植物病害[13]。丝核薄膜革菌是烟草靶斑病的致病菌[14]。白囊耙齿菌是一种较常见的木腐真菌，我国除海南外，其他省份均有分布，是一种食药用价值较高的常见真菌，近年来已经驯化栽培成功[15, 16]。以上菌类目前尚未见其对食用菌的危害报道。

木霉属真菌既能引起食用菌菌丝体的竞争性病害，还能引起侵染性病害。其菌丝生长速度都很快，均在接种后10天内就与金针菇菌丝交界。木霉菌适应性强，传播蔓延快[17]，优势木霉菌能侵入并覆盖食用菌菌丝体[18]，寄生于多种食用菌子实体上。如香菇[19]、双孢蘑菇[20]、平菇[21]、木耳[22]、金针菇[23]、草菇[24]、姬菇[25]、鸡腿蘑[26]、灵芝[27]等几乎所有食用菌在菌种制作及栽培过程中都易受其侵染危害。从侵染性试验结果看，哈茨木霉的侵染性很强，可在已封面的金针菇培养基上生长，产生极大危害。

Savoie等[28]对香菇和哈茨木霉进行对峙培养的结果，其菌丝交界处常会产生棕褐色的拮抗线，在拮抗过程中，香菇菌丝所分泌的锰过氧化物还原酶活性降低，对峙培养后的香菇菌丝生长速度显著减慢。Dennis等[29]的研究结果，哈茨木霉菌丝通过缠绕、产生钩状分枝缠绕及形成附着胞等3种方式作用于宿主菌丝。Wang等[30]研究发现哈茨木霉菌丝对香菇菌丝存在缠绕现象。在互作过程中，哈茨木霉所产生的几丁质酶和1,3-β-D 葡萄糖苷酶的活性均高于其单独培养，在降解真菌细胞壁时这些胞外酶有着关键作用[31, 32]。Badalyan等[33]对哈茨木霉与金针菇菌丝在平板内进行对峙培养时发现，哈茨木霉能快速长满平板并覆盖金针菇菌丝。熊小龙[34]研究哈茨木霉对金针菇侵染能力，发现其存在种间的差异性，而哈茨木霉和金针菇间的作用机制还有待于探明。

根据本研究结果，金针菇工厂化生产环境中存有多种具有致病性的真菌，建议企业定期监测洁净室环境，掌握洁净区的浮游真菌群落结构，采取相应的消毒措施，降低浮游真菌浓度，保证生产安全。

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国家食用菌产业技术体系（CARS-20）

蔡婧（1988—），女，硕士，农艺师，主要从事食用菌育种与栽培研究。

，E-mail：xyfungi@163.com。

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2095-0934（2021）01-070-04