应用CRISPR/Cas9系统构建大肠埃希氏菌irp2基因缺失株

富国文，单春兰，敖平星，赵 汝，高丽波，刘超英，高 洪

(云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201)

耶尔森氏菌强毒力岛(Yersiniahigh-pathogeniticity island，HPI)主要含有与摄铁有关的毒力基因簇[1]。研究表明，耶尔森氏菌HPI不仅可以通过耶尔森氏菌素(Yersiniabactin，Ybt)的铁载体夺取宿主中的铁元素进而加重机体的感染，而且可在耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌(E.coli)之间水平传播，与致病性E.coli的毒力进化有着密切的关系[2]。Schubert S等研究发现携带功能性HPI的肠外致病性大肠埃希氏菌与传统的毒力因子菌毛、荚膜、侵袭素和其他铁载体相比HPI具有最强的毒力[3]。irp2基因为HPI的标志基因，与摄铁功能相关，该基因表达的高分子量蛋白对Ybt的合成具有重要作用，被认为是Ybt阳性表型表达所必需，因此，经常通过构建irp2基因缺失菌株来研究HPI的致病机制。

2013年，新型基因组编辑技术CRISPR/Cas(成簇有规则间隔短回文重复)系统的出现，迅速受到全世界科研人员的关注。该系统广泛存在于细菌和古生菌中，构成了对抗外来核酸入侵的适应性免疫系统。CRISPR/Cas技术在过去几年极大地提高了基因工程能力[4]。通常，CRISPR/Cas系统由CRISPR RNA (crRNA)和Cas蛋白组成。crRNA与靶序列互补，引导Cas蛋白进行序列特异性识别和裂解。然后，可以通过容易出错的非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)引入基因修饰，从而产生精确的基因组修饰[5]，大多数原核生物使用HDR[6-8]。相比传统基因工程策略，如λ-Red recombineering，CRISPR/Cas是一种可自由标记、广泛的、高效的基因编辑方法，更容易获得阳性克隆[9-10]。CRISPR/Cas系统分为一类和二类，这两类系统分别基于多蛋白效应复合物和单一Cas蛋白。根据CRISPR/Cas系统的复杂性和特征蛋白，将其进一步划分为6种类型(Ⅰ～Ⅵ型)。其中，Ⅱ-A型CRISPR/Cas9作为细菌的遗传工具得到了最广泛的研究和开发[11]。本研究运用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建撒坝猪致病性E.coliirp2基因缺失菌株，可以为进一步研究HPI的致病机制及疫苗开发提供技术基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒与实验动物E.coliA/10菌株，云南农业大学动物病理学实验室分离鉴定自腹泻撒坝猪粪便，并证实该菌株具有致病性；大肠埃希氏菌DH5α，本实验室保存;质粒pTargetF(含有博莱霉素抗性)和pCas(含卡那霉素抗性)，西北农林科技大学杜恩岐副教授馈赠；昆明小鼠，由昆明医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 2×EasyTaqPCR Super Mix、DNA标准，北京百泰克生物有限公司产品；SpeⅠ酶、HindⅢ酶、T4连接酶、核酸染料、琼脂糖，50×TAE，宝生物工程(大连)有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；博莱霉素、卡那霉素、L-阿拉伯糖，Gibco公司产品，使用浓度分别为25 mg/L和50 mg/L；LB培养基，广州环凯微生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 1652660型电穿孔仪(Gene Pulser Xcell)、T100型PCR仪，美国伯乐有限公司产品；FA1004N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司产品；YXQ-SG46-280型不锈钢压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；DYCP-31BN型电泳仪、WD-9403F型凝胶成像仪，北京六一生物科技有限公司产品；H1850R型高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司产品。

1.1.4 引物 根据本实验室已测序的E.coliA/10菌株irp2基因序列设计上、下游同源臂扩增引物arm-up和arm-down；以pTargetF质粒基因序列为模板设计sgRNA-irp2；以pCas和pTargetF质粒基因序列为模板设计鉴定引物pCas-JD和pTargetF-JD；于上游同源臂上方，下游同源臂下方设计缺失株鉴定引物Δirp2-JD；引物由擎科生物科技有限公司合成。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 pTargetF重组质粒构建 按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明提取E.coliA/10基因组，置-20 ℃保存备用。以arm-up-F、arm-up-R、arm-down-F和arm-down-R为引物，以E.coliA/10菌株基因组DNA为模板，分别扩增上、下游同源臂。以sgRNA-irp2-F和sgRNA-irp2-R为引物，以pTargetF质粒为模板，扩增sgRNA-irp2。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察拍照，胶回收试剂盒回收，分别命名为arm-up、arm-down和sgRNA-irp2，置-20 ℃保存备用。

以sgRNA-irp2-F和arm-up-R为上、下游引物，sgRNA-irp2和arm-up为模版进行PCR扩增，产物命名为sgRNA-irp2+arm-up。再以sgRNA-irp2-F和irp2-down-R为上、下游引物，以sgRNA-irp2+arm-up和arm-down为模版进行PCR扩增，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察拍照，胶回收试剂盒回收，命名为sgRNA-irp2+arm-up+arm-down，置-20 ℃保存备用。

利用SpeⅠ和HindⅢ酶对sgRNA-irp2+arm-up+arm-down和pTargetF质粒进行双酶切，酶切体系：SpeⅠ酶1 μL，HindⅢ酶1 μL，pTargetF质粒/sgRNA-irp2+arm-up+arm-down 18 μL，buffer 5 μL，水25 μL，混匀，37 ℃水浴2 h，胶回收试剂盒回收产物，待用。上述酶切产物以T4连接酶进行连接，酶接体系：T4连接酶5 μL，pTargetF质粒酶切产物1 μL，sgRNA-irp2+arm-up+arm-down酶切产物4 μL，16 ℃水浴1 h，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察拍照，胶回收试剂盒回收产物，待用。将构建的pTargetF重组质粒电转化至DH5α感受态细胞，方法参见文献[12]，接种于含有25 mg/L博莱霉素的LB液体培养基中37 ℃过夜培养，提取质粒，置-20℃保存，备用。

1.2.2 CRISPR/Cas9介导的irp2基因缺失 以E.coliA/10菌株制备电转感受态细胞，方法参见文献[12]。将pCas电转化E.coliA/10感受态细胞，接种于50 mg/L卡那霉素的LB平板，30 ℃过夜培养，挑取单克隆菌落，以pCas-JD-F和pCas-JD-R为引物进行PCR扩增。挑取pCas阳性克隆菌接种于含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中，30℃、180 r/min培养至OD 600nm为0.2时，向摇瓶中加入终浓度为10 mmol/L的L-阿拉伯糖诱导pCas载体上λ-Red蛋白的表达，继续摇至OD 600 nm≈0.5时回收菌体，同上方法制备电转感受态细胞。电转化pTargetF重组质粒，接种于含有50 mg/L卡那霉素和25 mg/L博莱霉素的LB平板上，30 ℃过夜培养，筛选阳性转化子。挑取阳性转化子接种于含有50 mg/L卡那霉素和0.5 mmol/L IPTG的LB液体培养基中，30 ℃过夜培养，取100 μL培养菌液稀释后涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB平板上，在30 ℃培养12 h。随机挑取单克隆菌落，接种于含有25 mg/L博莱霉素的液体LB中，筛选不能生长的单克隆菌。挑取该单克隆菌接种于无抗性的液体LB中，在37 ℃培养8 h～12 h，稀释涂板，随机挑取单克隆菌，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，筛选不能生长的克隆菌。挑取上述步骤筛选出的单克隆菌，以Δirp2-JD-F和Δirp2-JD-R为引物进行PCR扩增，产物送昆明擎科生物科技有限公司测序，正确的菌株命名为E.coliΔirp2-A/10。

1.2.3 生长曲线测定 挑取E.coliA/10与E.coliΔirp2-A/10菌株单克隆接种于LB液体培养基过夜培养，调整OD 600 nm≈0.5，分别按1∶100的比例接入20 mL的LB培养基中，150 r/min，37 ℃振荡培养，每隔1 h测定OD600 nm，绘制生长曲线。

1.2.4 LD50的测定 将E.coliA/10与E.coliΔirp2-A/10菌株用LB培养基稀释至2.5×1010、2.5×109、2.5×108、2.5×107、2.5×106CFU/mL共5个稀释度。试验用小鼠共分为3组，E.coliA/10组50只，每个稀释度10只；E.coliΔirp2-A/10组50只，每个稀释度10只；对照10只组注射LB液体培养基，各组小鼠按照0.1 mL/只的剂量进行腹腔注射。注射后24 h记录各组死亡数量，用Reed-Muench法计算半数致死量。

2 结果

2.1 pTargetF重组质粒构建结果

本试验中用于敲除irp2基因的arm-up大小为500 bp。arm-down大小为481 bp，其前端带有与arm-up末端互补的15个碱基序列，用于连接arm-up；末端带有HindⅢ酶切位点，用于连接pTargetF质粒。sgRNA大小为139 bp，其前端带有SpeⅠ酶切位点，用于连接pTargetF质粒；末端带有与arm-up前端互补的15个碱基序列，用于相互连接arm-up。PCR扩增后，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，各目的片段大小符合预期(图1A)。

利用重叠PCR扩增的方法，首先将sgRNA与arm-up进行连接，连接产物再用同样的方法与arm-down连接；接合后片段大小应为1 120 bp。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，目的片段大小符合预期(图1B)。

pTargetF质粒经SpeⅠ和Hind Ⅲ双酶切，回收2 224 bp处产物(图1 C)与sgRNA-irp2+arm-up+arm-down的双酶切产物以T4连接酶连接，电转化至DH5α感受态细胞后，于含有25 mg/L博莱霉素的LB平板上长出单克隆菌落。提取质粒后以pTargetF-JD-F和pTargetF-JD-R为引物进行PCR扩增，PCR产物大小204 bp，符合预期(图1D)，表明重组质粒构建成功。

2.2 pCas质粒介导的irp2基因缺失

E.coliA/10转入pCas质粒，在含有卡那霉素的LB平板上长出单克隆菌，以pCas-JD-F和pCas-JD-R为上、下游引物进行PCR扩增，产物大小340 bp，符合预期(图1E)。电转入pTargetF重组质粒后，在含有卡那霉素和博来霉素的LB平板上有单克隆菌长出。经IPTG诱导，随机挑取的3个单克隆菌在含有博莱霉素的LB液体培养基中均不生长，表明pTargetF质粒被消除。消除pTargetF质粒的单克隆菌37 ℃过夜培养涂板后，随机挑取的8个单克隆菌中有2个不能在含有卡那霉素的LB液体培养基中生长，pCas质粒被消除。以位于同源臂上下游的缺失株鉴定引物进行PCR扩增，PCR产物大小1 267 bp，符合预期(图1F)。目的条带测序结显示irp2基因6 109 bp被删除，表明E.coliA/10 irp2基因缺失菌株构建成功。

M.DNA 标准DL 2 000;A：1.靶向irp2的sgRNA；2.下游同源臂；3.上游同源臂500 bp；B：sgRNA连接上下游同源臂；C：pTargerF酶切产物2 224 bp；D：pTargerF鉴定产物；E：pCas转化鉴定产物；F：1.A/10菌株；2.Δirp2-A/10菌株鉴定产物M.DNA Marker DL 2 000;A:1.sgRNA-irp2；2.Arm-down(481bp)；3.Arm-up(500 bp)；B:sgRNA-irp2+up-arm+down-arm；C:Plasmid enzyme digestion product of pTargerF；D:pTargerF plasmid identification product；E:pCas identification product(340 bp)；F:1.E.coli A/10 strain；2.Identification product of irp2 deletion strain

2.3 irp2基因缺失对菌株生长的影响

E.coliA/10和E.coliΔirp2-A/10菌株在37 ℃、150 r/ min的LB培养基中的生长曲线见图2。两者在各测试点生长速率差异不显著(P>0.05)，表明irp2基因缺失对该菌株在LB培养基中的增殖无显著影响。

图2 E.coli A/10与E.coli Δirp2-A/10菌株生长曲线

2.4 irp2基因缺失对菌株致病力的影响

小鼠半数致死量测定结果见表2。irp2基因缺失前E.coliA/10的LD50为9.57×107CFU/mL，缺失后为5.20×108CFU/mL，表明irp2基因缺失降低了原菌株的致病力。

表2 亲本株与irp2缺失株LD50的测定

3 讨论

毒力岛是细菌编码重要的毒力、抗生素耐药性和其他辅助功能的基因组成员，在细菌基因转移中也具有重要作用，HPI是其中之一。HPI首先发现于耶尔森氏菌，含有编码摄取、合成铁载体耶尔森氏菌素(Ybt)的基因及其调节基因，是决定此菌致病性和毒力大小的重要因素之一。之后的研究发现，HPI也存在于其他肠杆菌中，大肠埃希氏菌、枸橼酸杆菌 、沙门氏菌、克雷伯菌等[13]。Paauw A等[14]的研究发现，Ybt不仅通过对三价铁的高亲和力，还通过激活免疫细胞减少活性氧的产生来促进细菌生长。Magistro G等[15]研究了HPI和鞭毛介导的运动性之间的关系，发现HPI中的irp2或ybtA基因缺失对肠致病性大肠埃希氏菌的运动能力有显著影响。Tu J等[16]对禽致病性大肠埃希氏菌研究发现，敲除HPI中的irp2和fyuA基因，该菌对DF-1细胞的黏附能力减弱，雏鸡的致病性降低。这些研究表明，除了获取铁的功能外，HPI还在许多过程中发挥作用，而本研究获得的irp2基因缺失菌株可以为进一步研究其致病机制提供试验材料。

在细菌致病机制的研究中，广泛使用基因编辑的方法。Red同源重组是E.coli基因编辑的传统方法,但该系统存在明显的不足,如操作步骤复杂、重组率低等，极大地降低了敲除的效率。相较于传统方法,改进后的两步同源重组方法操作相对简单、周期短，成为E.coli基因敲除中最为常用的方法之一。但该方法对DNA片段的浓度要求高，达不到要求的菌株会失败，影响打靶效率，且会留下外源片段[17]。本实验室长期使用该方法构建大肠埃希氏菌基因缺失菌株，但成功率低。而近年来出现的ZFN和TALEN技术虽然先后被用于E.coli的基因编辑，但由于设计繁琐、过度依赖于目标序列及其上、下游序列、高脱靶率和较大的细胞毒性等因素未得到广泛应用[18]。

与以上基因编辑工具相比，CRISPR/Cas系统具有以下优势：首先，CRISPR/Cas可以高效的断裂目标序列；其次，可以结合λ-Red重组酶，实现精确、高效、无标记的基因编辑[19]。Jiang Y等[19]研究发现，CRISPR/Cas系统进行E.coli基因编辑时，同时在pTargetF重组质粒中引入同源臂，在pCas质粒中引入λ-Red重组酶，效率显著高于其他方式。因此本研究中，首先将靶向irp2基因的sgRNA与上、下游同源臂进行连接。在引物的设计过程中，应综合考虑片段之间的连接和酶切位点的位置。将pCas和pTargetF重组质粒转入宿主菌后，IPTG诱导pCas质粒上靶向pTarget F重组质粒中pMB1的sgRNA-pMB1的表达，pTarget F重组质粒上的NGG20快速的锚定细菌基因组上的NGG20，进行双链断裂和重组修复，从而高效获得突变体。该过程引起pTarget F质粒的丢失，虽然不能达到100%的消除，但效率比较高[19]。在本试验中随机挑取的3个单克隆菌均未表现出博莱霉素抗性。pCas为温度敏感型质粒，37 ℃条件下培养会自行丢失。在本试验中随机挑取10个单克隆菌，有2个消除成功。生长曲线测定结果表明，在LB培养基中irp2基因缺失对菌株的生长无显著影响，这可能与大肠埃希氏菌还有其他获取铁的方式有关，如肠菌素、沙门氏菌素、气杆菌素等。小鼠半数致死量测定结果表明，irp2基因缺失后，菌株的致病力降低，这与Paauw A等[14]的研究结果相一致，但其确切的作用机制有待进一步研究。

本研究采用CRISPR/Cas基因编辑技术对临床分离的撒坝猪致病性E.coli中的irp2基因进行编辑，成功获得了缺失菌株E.coliΔirp2-A/10，可以为进一步研究irp2基因在该菌株致病中的作用提供试验材料，同时也为利用该技术开展E.coli基因功能研究和疫苗开发提供参考。