靶向SynDIG1的shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

李亚琳，史秀超，权美平

(渭南师范学院环境与生命科学学院， 陕西渭南 714099)

突触分化诱导基因(synapse differentiation induced gene 1，SynDIG1)是一种高度保守的跨膜蛋白，在中枢神经系统的兴奋性突触传递和突触可塑性调节中起着重要的作用[1]。研究发现SynDIG1是α-氨基-3-羟基- 5-甲基-4-异恶唑丙酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isooxazolpropionic acid，AMPA)受体上的调节蛋白，SynDIG1表达水平的改变会引起突触中AMPA受体的明显改变[2]。研究小组把神经细胞从大鼠的海马体神经元中分离出来，经过检测，发现SynDIG1和AMPA受体同时存在于突触后膜，并在突触形成的早期阶段就已经存在。SynDIG1可通过跨膜突触调节分子调控突触前蛋白，进而影响突触发育，还可以激活AMPA受体表达，通过胞吐作用将AMPA受体转移，进而促进突触发育[3-4]。有研究发现通过调节神经细胞中的SynDIG1表达水平，能够改变突触的数量和质量。SynDIG1表达降低时，AMPA受体的数量减少，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体的传递速率降低，同时突触变小，数量也会减少；反之，当SynDIG1表达增强，会促进AMPA受体的形成使其数量增加，NMDA受体的传递速率提高，突触会更加成熟稳定，这表明SynDIG1对突触形成、发育以及寿命等有着至关重要的作用[4]。但是，SynDIG1促进突触发育和调节突触可塑性的分子机制尚不明确。

随着分子生物学研究技术的发展，基因敲除和基因敲减技术的应用也越来越广泛。从最早的自杀质粒，到RNA干扰以及锌指核糖核酸酶技术，虽然现在也发展了CRISPR基因编辑技术，但基于慢病毒载体的shRNA基因敲减技术在实验室研究中仍然被普遍应用[5-6]。为了探索SynDIG1在突触分化发育以及神经传导中的作用机理，本研究以人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)的质粒pLKO.1为载体，构建靶向SynDIG1的shRNA，从而人为降低SynDIG1的表达量，为分析该蛋白在突触分化以及可塑性调节中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和质粒 从怀孕18 d的大鼠胚胎脑组织分离出海马区神经元细胞，进行原代培养；HEK293T细胞,购自空军医科大学实验动物中心；PLKO.1-GFP质粒、慢病毒包装载体，美国Addgene Cambridge MA公司产品。

1.1.2 抗体和试剂 鼠抗Tubuin(1∶5 000)，美国Sigma-Aldrich，St.Louis，MO公司产品；鼠抗SynDIG1(蛋白印迹1∶1 000，免疫荧光1∶500)，英国Abcam Cambridge公司产品；辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，(1∶5 000)，美国Bio-Rad,Hercules，CA公司产品；Alex Fluor 594标记的羊抗鼠IgG(1∶700)，美国Invitrogen，San Diego，CA公司产品。T4 DNA Ligase、AgeⅠ-HF、EcoRⅠ-HF、CutSmart、T4PNK Kinase、CIP，美国New England Biolabs，Ipswich，MA公司产品；Lipofectamine 2000，美国Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA公司产品；PEI质粒提取试剂盒，美国Sigma-Aldrich，St.Louis，MO公司产品。

1.1.3 仪器设备 冷冻高速离心机(5810R)，德国Eppendorf公司产品；PCR仪器(T100 Thermal Cycler,CA)、凝胶成像系统(ChemiDoc MP)，美国Bio-Rad公司产品；紫外分光光度计(NanoDrop2000，MA)、生物安全柜(1300 A2)，美国Thermo Scientific公司产品；CO2培养箱(力康HealForce,HF90)；倒置荧光显微镜(CKX41)，日本Olympus公司产品。

1.2 方法

1.2.1 神经细胞元代培养 怀孕18 d的大鼠，取其胚胎并分离脑皮质和海马组织进行原代培养。组织先用含有木瓜蛋白酶的Hanks平衡缓冲液在37 ℃消化15 min，然后用DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)配制的包含1 mg/mLDNA酶、10 mg/mL卵脂黏蛋白、10 g/L牛血清白蛋白的研磨缓冲液研磨，直到神经元完全分离。分离的海马神经元计数并接种于提前用多聚赖氨酸包被的60 mm培养皿或6孔板中进行培养。初分离的细胞用包含100 mL/L胎牛血清(Atlanta Biologicals，Flowery Branch，GA，USA)、50 mL/L马血清、60 mg/L的L-半胱氨酸，10 mg/mL青霉素/链霉素(Corning，Corning，NY，USA)和60 mg/L L -谷氨酰胺的DMEM进行培养。细胞接种的第2天更换包含10 mL/L马血清、20 mL/L胎牛血清、10 mg/mL青霉素/链霉素和60 mg/L L-谷氨酰胺的DMEM营养培养基，之后3 d更换1次营养培养基，直到细胞被用。

1.2.2 shRNA设计 GenBank查到大鼠SynDIG1基因mRNA序列，用siRNA Wizard v3.1(Invivogen,San Diego,CA)找出靶点序列并设计1对21-mer的SynDIG1 shRNA序列(下划线部分)，根据pLKO.1的shRNA Oligos设计原则设计出1对引物，引物序列如图1所示，5＇端设计有AgeⅠ (CCGG)和EcoRⅠ(AATT)酶切位点以便克隆到pLKO.1-GFP载体上。

图1 靶向SynDIG1的shRNA Oligos引物(下划线为shRNA序列)Fig.1 Sequences of shRNA Oligos targeting SynDIG1(underline shows shRNA sequence)

1.2.3 载体构建 合成好的Oligos用ddH2O溶解成100 μmol/L,2条引物进行退火，反应体系如下：正向反向引物各1 μL，10×NE buffer 5 μL， ddH2O 43 μL,共50 μL。反应条件如下：95 ℃ 5 min;70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20 ℃各30 min，最后16 ℃终止反应。得到的退火产物用PNK进行末端磷酸化，反应体系：T4PNK Kinase 1 μL,10×T4DNA Ligase buffer(含ATP)5 μL，退火产物50 μL，共56 μL体系在37 ℃反应1 h。

质粒PLKO.1-GFP用AgeⅠ-HF、EcoRⅠ-HF和Cut Smart 37 ℃反应1 h进行消化，然后用CIP 37 ℃ 30 min进行去磷酸化阻止质粒自连。得到的产物进行8 g/L的琼脂糖凝胶电泳，切下7 kb的大片段用QIAGEN凝胶回收试剂盒进行纯化，用ddH2O溶解并调整溶度到100 ng/μL。

处理好的shRNA和质粒PLKO.1-GFP进行连接反应。体系如下：PLKO.1-GFP消化产物 0.7 μL，oligo退火产物4 μL，T4Ligase 1 μL，10×T4DNA Ligase buffer(含ATP) 2 μL，ddH2O 12.3 μL，共20 μL，室温反应90 min。同时做一个不加shRNA的阴性对照。

1.2.4 重组克隆子筛选 取出-80 ℃冻存的感受态菌DH5α(40 μL分装)，冰上融化后，加入20 μL连接产物，轻轻混匀置冰上20 min，42 ℃ 热激1 min，快速置于冰上冷却2 min，加入不含抗生素的LB培养基400 μL，37 ℃、200 r/min摇床上旋转1 h使细菌复苏，所有的转化细菌涂于预热的含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上培养18 h。

1.2.5 DNA测序 挑选阳性克隆子重悬于3 mL的LB培养液37 ℃、250 r/min培养过夜，QIAGEN试剂盒进行质粒抽提并测定DNA浓度。用25 pmol的PLKO.1通用引物和重组质粒约800 ng共15 μL体系进行测序。对阳性克隆子进行培养并抽提其质粒DNA。

1.2.6 病毒包装 用pLKO.1 慢病毒包装载体pLP1、pLP2、pLP VSV-G以及质粒pLKO.1-GFP(对照)和pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA共转染HEK293T细胞，用DMEM和转染试剂PEI转染48 h，收集上清15 mL，1 200 r/min 5 min离心去除细胞残渣，PEG 4 ℃过夜沉淀病毒，5 mL PBS溶解病毒并分装保存于-80 ℃。

1.2.7 细胞转染和感染 用Lipofectamine 2000转染试剂盒，转入重组pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA到细胞进行功能验证，HEK293T细胞在70%～80%饱和度时转染，海马神经细胞在DIV11(daysinvitro)时转染。将目的DNA和转染试剂lipofectamine分别与50 μL的OPTI-MEM混合后静置5 min，DNA和转染试剂比例为1 μg∶1 μL，然后将这两者混合室温孵育20 min。总体积约100 μL的混合液加到细胞中，十字晃动孔板混匀，置于培养箱中培养。转染4 h后，用预热的新鲜培养基替换掉转染试剂，继续培养。

包装好的慢病毒重组病毒颗粒从冰箱取出后室温放置10 min，彻底融化后直接加入孔板原代培养的DIV14或DIV2的大鼠海马神经细胞，200 μL/孔，24 h后换上新鲜培养液，继续培养7、9、12 d。

1.2.8 免疫印迹 HEK293T细胞以1×105个/ 孔接种于6孔板，第2天用pLKO.1-GFP和HA-SynDIG1(对照组)以及 pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA 和HA-SynDIG1(试验组)进行共转染24 h。原代培养的大鼠海马神经细胞分别加入之前包装好的Lentivirus，分别感染7、9、12 d。

处理结束后提取细胞总蛋白，进行100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并转膜。用脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃冰箱中孵育过夜。第2天取出膜，洗净后加入HRP标记的IgG二抗(1∶4 000),室温杂交1 h。加入ECL显色， 凝胶成像系统检测蛋白表达情况。

1.2.9 免疫荧光化学 DIV11海马神经细胞用Lipofectamine 2000试剂分别转染pLKO.1-GFP和pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA 48 h。用冰冷的ACSF(artificial cerebrospinal fluid)清洗2次，在40 mg/mL多聚甲醛溶液中室温固定10 min，然后用3 mL/L Triton X-100渗透细胞膜10 min，PBS洗3次，100 mg/mL羊血清封闭1 h，加入SynDIG1一抗4 ℃孵育过夜。第2天取出细胞，用PBS洗涤后，再与Alexa594标记的荧光二抗室温孵育1 h，PBS洗涤后用抗淬灭试剂封片，荧光显微镜观察细胞中SynDIG1的表达并拍照。

2 结果

2.1 pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA重组质粒的获得

pLKO.1-GFP用AgeⅠ-HF和EcoRⅠ-HF消化后，得到7 kb和1.9 kb的2个片段(图2)。7 kb片段纯化后与退火的SynDIG1 shRNA连接，得到5个阳性克隆子，测序后有3个提前终止反应，其余2个序列正确。

图2 用AgeⅠ-HF和EcoRⅠ-HF消化pLKO.1-GFP

2.2 重组质粒在HEK293T细胞中抑制外源SynDIG1的表达

HEK293T细胞为人胚肾细胞，插入SV40 T-抗原的温度敏感基因后产生的高转染效率的衍生株，本身并不表达SynDIG1。用序列正确的2个阳性pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA质粒与HA-SynDIG1共转染HEK293T细胞，24 h后检测SynDIG1在其中的瞬时表达。如图3所示，可以看到2个重组质粒都能敲减外源SynDIG1的表达，质粒1敲减率为38.2 %，而质粒2敲减率为74.8 %。与对照比较，两个质粒对SynDIG1表达的敲减差异均极显著(P<0.01)。

A.SDS-PAGE;B.表达量；**P<0.01A.SDS-PAGE;B.Expression level；**P<0.01

2.3 重组质粒对神经细胞中SynDIG1表达的抑制

用重组质粒2转染DIV11神经细胞48 h，然后进行免疫荧光染色检测SynDIG1的表达。如图4所示，pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA重组质粒能够敲减神经细胞中SynDIG1的表达，对细胞胞体中SynDIG1敲减率达到46.6 %，具有极显著差异(P<0.01)；而在细胞树突，其敲减率为28.7%，具有显著差异(P<0.05)。

A.免疫荧光染色;B.表达量A.Immunofluorescence staining;B.Expression level

2.4 SynDIG1 shRNA慢病毒感染对神经细胞中SynDIG1表达的影响

用包装好的慢病毒颗粒分别感染DIV2和DIV14神经细胞，试验随机选择的感染时间为7、9、12 d。由图5可以看出病毒感染后，SynDIG1的蛋白表达明显降低，而且DIV2细胞中SynDIG1蛋白敲减率明显高于DIV14细胞，达到75%以上。

A.SDS-PAGE;B.表达量A.SDS-PAGE;B.Expression level

3 讨论

通过RNA干扰或RNA沉默进行基因敲除或敲减是研究基因功能的一种常用方法。在哺乳动物细胞中，RNA干扰(RNAi)或RNA沉默可以通过瞬时siRNA(small or short interfering RNA)转染或通过稳定的shRNA (short hairpin RNA)导入来实现。已经有很多载体可以高效携带shRNA，而慢病毒载体是一种常用的shRNA运载工具，可以将shRNA带到哺乳动物细胞中并长期稳定的表达，能够感染神经细胞、造血干细胞、肝细胞等大多数细胞，具有基因片段容量大，免疫反应小等优点[7,8]。另外，作为载体的病毒一般都是缺陷型的，因此不会导致细胞死亡，被感染的细胞也能够连续传代增殖[9]。

Addgene公司开发的pLKO.1具有抗嘌呤霉素基因，可在哺乳动物细胞中进行选择，也有助于阳性克隆子的筛选，并且可以通过适当的包装产生慢病毒颗粒[10]。含有shRNA的质粒载体转染到细胞后，可与靶基因序列结合，阻止基因转录表达。经包装得到的慢病毒微粒感染细胞后，将shRNA序列引入到宿主细胞染色体，稳定表达发卡RNA，从而沉默靶基因的表达[11]。慢病毒载体因其稳定性较好而被广泛用于基因功能的研究中，而且基于 pLKO.1质粒载体建立的shRNA数据库也在逐渐扩大，这些资源为科学家研究特定基因的功能及其与其他基因的相互作用提供了有力的工具。

本研究以pLKO.1-GFP为载体构建了pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA，得到的阳性克隆子在测序过程中，有3个提前终止，说明载体本身纯度不够，最终仅得到两个正确的SynDIG1 shRNA。这些SynDIG1 shRNA不仅能够敲减HEK293T细胞中人为转入的外源SynDIG1的表达，也能够减少大鼠海马神经元细胞中内源性SynDIG1的表达，其敲减率达到了75 %。同时，用pLP1、pLP2、pLP VSV-G这3种包装质粒对pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA包装后形成的慢病毒，也能够有效并稳定的降低神经细胞中固有SynDIG1的表达，而且病毒感染时间越早，内源性SynDIG1的敲减效率也越高。本试验中DIV14神经细胞感染pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA慢病毒颗粒后，SynDIG1蛋白的敲减程度明显低于DIV2，这是因为DIV14神经细胞在病毒感染之前就已经产生了SynDIG1蛋白，并且在神经细胞中积累，在突触发育的早期发挥作用。而病毒感染只能阻止SynDIG1基因的转录，不能影响已经形成的SynDIG1蛋白，从而使DIV14神经细胞中检测到的SynDIG1蛋白增加。通过利用HEK293T以及大鼠海马区神经细胞所做的试验，证明了本研究得到的重组pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA能够有效并稳定地敲减外源性以及内源性SynDIG1靶基因的表达。

本研究用pLKO.1-GFP作为载体，成功构建了靶向SynDIG1的pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA，该重组质粒以及包装后的慢病毒均能够有效地抑制内源性及外源性SynDIG1的表达，为SynDIG1的功能研究提供一个有力的工具，也为基于慢病毒载体的其他基因的shRNA载体构建提供了参考方法。