济南市犬瘟热病毒H基因遗传进化分析

王召阳，蒋亚君，刘雪婷，侯绍华，郭晓宇，鑫 婷，朱鸿飞，贾 红

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一种急性、高度接触性传染病[1]。CDV可引起多种食肉动物感染，发病率高，致死率高达50%[2]，严重威胁犬只健康。犬瘟热也对其他野生动物，包括东北虎[3]、大熊猫、狮子、猕猴[4-5]等造成严重威胁。临床症状主要包括眼鼻分泌物增多、双相热、腹泻、呕吐、足垫增厚和抽搐等[1,6]，且CDV常与其他病原(犬细小病毒、犬冠状病毒虫和滴虫等)共同感染[7-8]。

目前预防犬瘟热的主要方法是疫苗免疫接种，正确的疫苗接种可提供长期的免疫保护[9]，然而仍有免疫动物发生CDV感染的情况[10]。可能是CDV发生变异，导致疫苗免疫保护效果降低所致，因此对流行的CDV进行遗传进化分析具有重要意义。CDV是一种带囊膜的负链RNA病毒，属于副黏病毒科，麻疹病毒属[9]，包含6个基因区域，分别以独立、不重叠的转录单位排列的6个结构蛋白，包括核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、病毒聚合酶(L)、基质膜蛋白(M)、血凝素(H)和融合蛋白糖蛋白(F)[11]。其中，H蛋白是主要的抗原决定簇[12]，决定病毒的趋向性，在免疫应答中起关键作用，感染CDV恢复的犬可产生针对H蛋白的中和抗体，达到终生免疫[11]。有报道显示CDV免疫小鼠后，可筛选到具有中和活性靶向H蛋白单克隆抗体[13]。并且H蛋白存在糖基化位点，而糖基化与CDV的毒力有关[14]。同时，H蛋白变异率较高，常用于分析不同CDV毒株之间的遗传变异[9]，因此本研究选用CDV的H基因进行克隆及分析其遗传进化规律。

CDV毒株的基因型分布大体上遵循地理分布的原则[15]，但由于经济全球化的发展、各地区文化科技的交流，病毒的遗传进化也有所改变，Asia-Ⅲ和Asia-Ⅳ都曾在中国报道[9]。近期CDV在灵长类身上感染的报道[5]也提示该病毒有感染人类的潜在可能性[16]，因此监测CDV流行情况极其重要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 采集2019年1月-6月济南市某宠物医院7份临床样品(眼鼻拭子)，置于-20℃保存。该样品均来自疑似患犬瘟热疾病的犬，并且犬瘟热抗原胶体金检测试纸条为阳性。

1.1.2 主要试剂 高保真酶(2×Phanta Max Master Mix)、DH5α感受态细胞、TA/Blunt-Zero Cloning Kit，南京诺唯赞公司产品；核酸染料，北京聚合美公司产品；胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒，Omega公司产品；AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep kit，康宁生命科学有限公司产品；反转录试剂盒，湖南艾科瑞生物工程有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 离心机(5430R)、PCR仪、移液器，Eppendorf公司产品；电泳仪,Bio-RAD公司产品；凝胶成像系统(Tanon 2500),上海天能科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料处理 按收集到样品的先后顺序进行编号，依次编号为SD-01、SD-02、SD-03、SD-04、SD-05、SD-06、SD-07。将眼鼻分泌物拭子置于含有0.5 mL PBS的EP管中，置于冰上5 min,并不时搅拌使眼鼻分泌物充分溶解到PBS中，反复冻融3次。12 000 r/min离心10 min，吸取上清200 μL，置于-80 ℃保存备用。

1.2.2 样品RNA提取及反转录 将制备好的样品按照AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit说明书进行提取。提取完成后按照Evo M-MLV RT for PCR Kit说明书进行反转录。

1.2.3 引物设计与合成 根据GenBank公布的CDV H基因序列信息，利用DNAMan软件设计引物如下，H-F:5`-ATGCTCTCTTACCAAGACAAG-3`;H-R:5`-TCAAGGTTTTGAACGGTT-3`。引物由北京诺赛基因公司进行合成。

1.2.4 H基因的扩增及克隆 首先PCR扩增CDV H基因，反应体系按2×Phanta Max Master Mix 推荐设计，具体如下：Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL(10 mmol/L)，反转录cDNA 4 μL，ddH2O 17 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 2 min，共35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物进行核酸凝胶电泳。参考TA/Blunt-Zero Cloning Kit说明书，连接至blunt-zero载体，转化至DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞。涂布于含有氨苄青霉素的琼脂板，挑取单克隆菌落，送至北京诺赛基因公司进行测序。

1.2.5 H基因序列分析 利用Meg Align软件，将测序结果与NCBI上的CDV序列以及NCBI Blast分析近似序列进行同源性分析,并利用MEGA6软件根据氨基酸序列构建系统进化树，采用最大似然法、Bootstrap值(1 000)进行分析。利用NetNGlyc 1.0进行H基因潜在糖基化位点的预测，并与典型的毒株序列进行比对。利用Protein软件进行H基因抗原表位预测，并与常见疫苗株H基因抗原表位进行对比。

2 结果

2.1 CDV H基因扩增

反转录获得cDNA，以H-F、H-R为引物进行PCR扩增，目的片段长约1 824 bp，与预期相符(图1)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～7.随机采集临床样本SD01～SD07M.DNA Marker DL 2 000;1-7.Clinical samples SD01-SD07

2.2 CDV H基因同源性分析

利用DNA Star软件中的Meg Align进行同源性分析。结果显示,济南市犬瘟热H基因核苷酸、氨基酸同源性分别为98.7%～99.9%和98.7%～100%，而与疫苗株相比，核苷酸、氨基酸同源性分别为90.0%～90.9%和88.8%～91.4%(图2和图3)。

图2 济南市CDV与疫苗株核苷酸同源性分析

图3 济南市CDV与疫苗株氨基酸同源性分析

2.3 CDV H基因遗传进化树分析

参考NCBI部分参考毒株与7株检测毒株的H基因DNA序列，利用MEGA6软件，采用最大似然法构建系统进化树，结果显示，济南市7株毒株均属于Asia-Ⅰ型，均为强毒株，与疫苗株America-Ⅰ型遗传关系差异明显，其中SD06与北京分离株亲缘关系最近，SD-07与黑龙江分离株HRB-E8和HLJ-1-14亲缘关系最近，SD01、SD02与广东分离株GD1811和GD1810亲缘关系最近，SD-5形成一个相对独立的分支，介于广东分离株GD1810、GD1811与泰国分离株CDV6-TH/2014之间，SD03、SD04相对于其余5株形成一个相对独立的小分支，通过NCBI Blast分析也为匹配到相近的序列，可能是一个新的进化方向(图4)。

●表示本试验分离毒株●CDV strains in this study

2.4 CDV H基因主要氨基酸位点突变分析

由表1可知,Asia-Ⅰ型存在8个～9个潜在天冬酰胺糖基化位点，其中野毒株SD-07与MF100809.1相同，在309位缺失了潜在天冬酰胺糖基化位点。其余6株分离株均为9个潜在天冬酰胺糖基化位点。

表1 不同基因型H基因的N-X-S/T位点分布情况

2.5 CDV H基因抗原表位预测分析

利用DNA Star protein软件对疫苗株及野毒株进行CDV H基因抗原表位预测[17-18]。结果表明，疫苗株Onderstepoort和CDV3与野毒株在20-30、180-200、230-250、390-410、440-460、575-595位存在明显的抗原表位差异，其中SD01-SD07在25、230-250位预测抗原表位与疫苗株Onderstepoort和CDV3差异最为明显，SD07在180-200、440-460位预测抗原表位与疫苗株Onderstepoort和CDV3差异最为明显，SD05在390-410、575-595预测表位抗原与疫苗株Onderstepoort和CDV3差异最为明显(图5)。

图5 CDV H基因抗原表位分析

3 讨论

近年来，犬瘟热病毒的宿主范围逐渐扩大，严重威胁犬及野生动物的健康[19]。引起犬瘟热的CDV可经呼吸道感染、通过患病犬的分泌物进行传播，该病毒对热敏感，故冬春季节多发。病毒血凝素(H)蛋白的突变，特别是与信号淋巴细胞活化分子(signaling lymphocyte activating molecules，SLAM)受体结合位点的突变是导致宿主范围扩大的原因之一[20]。因此，监测CDV H基因变异情况，具有一定的公共卫生意义。

预防犬瘟热行之有效的方法是接种CDV疫苗，但接种疫苗后感染仍时有报道[21]。目前市场上主要的CDV疫苗为Onderstepoort株和CDV3株[17]，我国主要流行株为Asia-Ⅰ型。本试验通过预测比较7个野毒株与疫苗株 H基因核苷酸、氨基酸序列同源性，发现野毒株与疫苗株之间存在明显差异。7个野毒株的核苷酸序列同源性高达98.7%～99.9%，而与疫苗株相比，核苷酸同源性90.0%～90.9%。氨基酸序列分析显示，7个毒株之间的同源性为98.7%～100%，而与疫苗株的同源性为88.8%～91.4%，核苷酸序列和氨基酸序列同源性差异均较大。 H蛋白的氨基酸序列可用于系统进化树分析[22]，因此本试验通过H基因DNA序列成功构建系统进化树，结果表明，7株CDV野毒株均属于Asia-Ⅰ。其中SD-6与BJ17BC1同源关系最近，SD-07株与HRB-E8、HLJ-1-14同处一个分支，SD-01、SD-02和GD1810、GD1811同处一个小的分支，值得注意的是SD-03和SD-04形成了一个单独的小分支，说明同一地区的CDV具有较高的遗传多样性，但基本遵循地理分布的原则[13]。糖基化是决定许多蛋白质抗原性的重要因素，潜在天冬酰胺糖基化位点主要与病毒的毒力、复制和抗原性有关[23]。犬瘟热疫苗株Onderstepoort、CDV3，分别有4个、7个潜在天冬酰胺糖基化位点，而检测的CDV H基因存在8个～9个潜在天冬酰胺糖基化位点，这可能是造成免疫失败的原因之一。进一步预测分析表明，野毒株与疫苗之间预测存在的明显差异的抗原表位，也可能是免疫失败的原因之一,二者在20-30、180-200、230-250、390-410、440-460、575-595等多个位点存在明显的预测抗原表位差异。

本文通过检测济南市CDV基因型，对CDV H基因进行遗传进化分析，可监测病毒遗传进化情况，从而为疫苗改进及疾病预防提供一定的数据支持。